麥冬多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法的研究

胡 坪，喬晚芳，王 楠，陳 燁，黃 露，王月榮*

(1.上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室華東理工大學(xué)，上海 200237;2.華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237;3.馬爾文儀器公司，上海 200237)

多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定是其一級(jí)結(jié)構(gòu)研究的重要內(nèi)容，相對(duì)分子質(zhì)量的大小顯著影響多糖的性質(zhì)及其生物活性。一般來(lái)說(shuō)，多糖相對(duì)分子質(zhì)量越大，分子體積越大，越不利于多糖跨越多重細(xì)胞膜障礙進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用;但相對(duì)分子質(zhì)量過(guò)低，又無(wú)法形成產(chǎn)生活性的聚合結(jié)構(gòu)。因此，只有在一定的相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)，多糖才表現(xiàn)出其活性。不同多糖產(chǎn)生生物學(xué)活性的最佳相對(duì)分子質(zhì)量范圍不同［1］。

多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的測(cè)定方法很多，如端基法、分析超離心法、黏度法、蒸氣壓滲透法、膜滲透壓法、凝膠色譜、質(zhì)譜法、光散射法等［1］。其中，端基法［2］要求試樣中每一個(gè)多糖分子鏈端必須具有可以用化學(xué)方法分析定量的基團(tuán)，且基團(tuán)數(shù)目固定不變。分析超離心法［3］離心時(shí)間長(zhǎng)，通常要幾十小時(shí)。黏度法［4］是一種需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)測(cè)定方法，且測(cè)得的是多糖相對(duì)黏均分子質(zhì)量。蒸氣壓滲透法［5］適合于相對(duì)分子質(zhì)量小于3×104物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定，同時(shí)需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以測(cè)定K值。膜滲透壓法對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量較小的多糖測(cè)定誤差較大。

高效凝膠色譜法(HPGPC)是一種大分子化合物的分離分析方法，具有設(shè)備和操作簡(jiǎn)單、分辨率高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被藥典收載用于測(cè)定多糖的相對(duì)分子質(zhì)量與相對(duì)分子質(zhì)量分布［6］，是目前測(cè)定多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其分布最常用的方法。隨著質(zhì)譜分析儀器的不斷發(fā)展，特別是基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)的出現(xiàn)，采用質(zhì)譜法分析蛋白質(zhì)及多糖等生物大分子的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布成為研究熱點(diǎn)［7-8］。小角度激光光散射法是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定絕對(duì)方法。物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量直接由光散射信號(hào)通過(guò)Rayleigh光散射方程計(jì)算得到，因此不依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無(wú)需做校正曲線。將分子排阻色譜與小角度激光光散射檢測(cè)器法聯(lián)用(SECLALLS)，可以測(cè)得多糖混合樣品的純度和相對(duì)分子質(zhì)量分布等，是一種理想的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法［9-10］。

麥冬多糖為中藥麥冬Ophiopogon japonicus的主要成分之一。藥理研究表明，麥冬多糖具有抗心肌缺血、降血糖、抗腫瘤、免疫活性、耐缺氧等多種藥效［11-14］。本實(shí)驗(yàn)分別采用高效凝膠色譜聯(lián)用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器法、基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法和分子排阻色譜聯(lián)用小角度激光光散射法，對(duì)麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行測(cè)定和比較，為多糖化合物相對(duì)分子質(zhì)量及其分布測(cè)定的方法選擇提供參考，也可為麥冬多糖藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效凝膠色譜儀(Agilent，美國(guó))配備 Alltech 3300 ELSD檢測(cè)器(Grace，美國(guó));4800 plus MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀(AB Sciex，美國(guó));Viscotek GPCmax-TDA305多檢測(cè)器(示差折光檢測(cè)器、小角度激光光散射檢測(cè)器、粘度檢測(cè)器)GPC/SEC系統(tǒng)(Malvern，英國(guó))。

浙麥冬Ophiopogon japonicus(購(gòu)自浙江慈溪，由澳門(mén)科技大學(xué)姜志宏教授鑒定);DEAE-52(Whatman);Sephadex G-25、G-100(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司);標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-1(MW=1000)、T-2(MW=5000)、T-3(MW=12000)、T-4(MW=50000)(Fluka，Switzerland);2，5-二羥基苯甲酸(Sigma，美國(guó));硝酸鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);聚氧乙烯、葡聚糖(Malvern，英國(guó))。

2 方法與結(jié)果

2.1 麥冬粗多糖的提取和純化［15］精密稱取500 g浙麥冬藥材，粉碎，過(guò)40目篩，以4倍量95%的乙醇回流提取1 h，冷卻，抽濾，藥渣置常溫晾干。取50 g干燥藥渣，加入500 mL去離子水，回流提取2 h，離心，上清液減壓濃縮，加入95%乙醇，使提取液含醇量達(dá)80%，靜置過(guò)夜，離心，沉淀冷凍干燥。取干燥沉淀適量，以去離子水溶解，依次用 DEAE-纖維素柱、Sephadex G100、Sephadex G25凝膠柱進(jìn)行純化，苯酚-硫酸法檢測(cè)，繪制洗脫曲線，根據(jù)洗脫曲線合并峰位溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得麥冬多糖。經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定，麥冬多糖的平均含有量為96.8% (n=3，RSD=0.7%)。

2.2 凝膠色譜測(cè)定方法 采用HPGPC-ELSD法對(duì)麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。方法為:取一定量的的麥冬多糖溶于純凈水中，配制成約1.0 mg/mL的溶液，用0.45μm水系濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液注入凝膠色譜儀分析。色譜條件為:采用TSK-GEL G3000PW 凝膠色譜柱(10μm，7.5 mm×30 cm)，流動(dòng)相為純水，體積流量 0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。ELSD氣體流量為1.6 L/min，漂移管溫度50℃，增益為1。結(jié)果麥冬多糖的凝膠色譜圖(圖1)中僅出現(xiàn)一對(duì)稱狹窄峰，說(shuō)明該多糖為均一多糖。

圖1 麥冬多糖的HPGPC-ELSD譜圖Fig.1 HPGPC-ELSD chromatogram of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

分別稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T-1(Mw=1000)、T-2(Mw=5000)、T-3(Mw=12000)、T-4(Mw=50000)，純水溶解后，配成質(zhì)量濃度約為1.0 mg/mL的溶液，取10μL注入凝膠色譜儀分析。以葡聚糖對(duì)照品的lgMw為縱坐標(biāo)，以洗脫體積VR為橫坐標(biāo)，通過(guò)GPC軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=－0.623x+9.302(r2=0.990)，計(jì)算得到麥冬多糖的Mn為1888 g/mol、Mw為 2376 g/mol、Mz為 2807 g/mol、Mp為 1971 g/mol，PD為1.23。分散系數(shù) PD=Mw/Mn，用來(lái)表征分散程度。PD越大，說(shuō)明相對(duì)分子質(zhì)量越分散，PD=1，說(shuō)明相對(duì)分子質(zhì)量呈單分散。麥冬多糖的PD為1.23＜2，表明其分散度較小。

2.3 MALDI-TOF-MS測(cè)定方法 采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行分析。方法為:將基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸(DHB)及多糖樣品均配成10 mg/mL水溶液，等體積混合均勻。采用滴液干燥法，取混合溶液0.5μL滴于樣品靶上，室溫晾干后，送入離子源進(jìn)行測(cè)定。質(zhì)譜條件為固體激光器頻率200 Hz，反射正離子模式，譜圖累加激光點(diǎn)400個(gè)。

圖2為MALDI-TOF-MS結(jié)果的部分放大圖。由圖可見(jiàn)，每個(gè)聚合度的麥冬多糖出現(xiàn)3個(gè)系列的規(guī)律性加合離子峰，表1列出了圖2中3個(gè)系列加合離子峰所對(duì)應(yīng)的m/z值，每組系列峰中相鄰兩峰之間的m/z值均相差162，與1個(gè)己糖殘基的質(zhì)量相符，說(shuō)明組成麥冬多糖的糖殘基單元為己糖。S1系列可能為環(huán)狀己聚糖或己聚糖脫水后的加鈉離子峰，S2為線形己聚糖的加鈉離子峰，S3為線形己聚糖的加鉀離子峰。結(jié)果表明，麥冬多糖樣品中主要存在線形和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的己聚糖，相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍主要在200～4000 g/mol之間。

圖2 麥冬多糖的MALDI-TOF-MS部分放大圖Fig.2 Part enlarge MALDI-TOF-MS spectrum of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

表1 麥冬多糖MALDI-TOF-MS圖中3個(gè)系列離子峰歸屬Tab.1 Assignment of the ion peaks in MS spectrum of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

通過(guò)MALDI-TOF-MS儀器的分析軟件計(jì)算得到麥冬多糖的 Mn為486 g/mol、Mw為721 g/mol、Mz為1094 g/mol，分散度為1.49。

2.4 SEC-LALLS測(cè)定方法 采用Viscotek GPC-max-TDA305多檢測(cè)器GPC/SEC系統(tǒng)對(duì)麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步分析。方法為:在室溫條件下，將麥冬多糖(7.22 mg/mL)溶于0.1 mol/L NaNO3溶液中，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，取續(xù)濾液進(jìn)GPC/SEC系統(tǒng)進(jìn)行分析。采用1 x A6000M色譜柱(Viscotek)，流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3，體積流量為0.7 mL/min，柱溫為35℃，檢測(cè)器溫度為35℃，dn/dc值為0.14，對(duì)照品為聚氧乙烯和葡聚糖，進(jìn)樣量為100μL。

以SEC-LALLS法測(cè)定得到的麥冬多糖的三重檢測(cè)器響應(yīng)色譜圖如圖3所示。

圖3 麥冬多糖的SEC-LALLS色譜圖Fig.3 SEC-LALLS spectrogram of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

由圖3可知，隨著保留體積的增大，麥冬多糖相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)曲線從大到小分布，各個(gè)檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)平滑、對(duì)稱、沒(méi)有拖尾，說(shuō)明該SEC-LALLS分離、測(cè)定條件適合麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。由圖3可見(jiàn)，黏度信號(hào)峰值最高點(diǎn)的保留體積小于示差檢測(cè)器信號(hào)峰值最高點(diǎn)的保留體積，這是因?yàn)榉肿优抛枭V使得相對(duì)分子質(zhì)量大的物質(zhì)優(yōu)先從色譜柱洗脫出來(lái)，同樣的濃度下，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量大小有響應(yīng)的黏度信號(hào)大于示差檢測(cè)器信號(hào);隨著麥冬多糖相對(duì)分子質(zhì)量小的物質(zhì)被洗脫出來(lái)，黏度信號(hào)小于示差檢測(cè)器信號(hào)，符合各檢測(cè)器響應(yīng)特性規(guī)律。

麥冬多糖的重量百分比(相對(duì)分子質(zhì)量分布)、累積重量比、Mark-Houwink曲線與相對(duì)分子質(zhì)量(Da)的分析圖見(jiàn)圖4。麥冬多糖樣品平行實(shí)驗(yàn)的計(jì)算結(jié)果如表2。

通過(guò)Rayleigh光散射方程和表2可得麥冬多糖的相對(duì)重均分子質(zhì)量為3962 g/mol，平均分散度為1.49，流體力學(xué)半徑為1.3 nm。圖4中特性黏度曲線的斜率即為Mark-Houwink a值，a值小于0.3樣品為球狀結(jié)構(gòu)，a值在0.7左右樣品為無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，a值為0.45，說(shuō)明麥冬多糖樣品在水相的構(gòu)象介于球狀和無(wú)規(guī)卷曲之間。

3 討論

圖4 麥冬多糖的重量百分比(相對(duì)分子質(zhì)量分布)，累積重量比和Mark-Houwink曲線圖譜Fig.4 Normalized weight fraction，Cumulativeweightfraction and Mark-Houwink spectrogram of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

表2 麥冬多糖的SEC-LALLS測(cè)定結(jié)果Tab.2 SEC-LALLS determination results of polysaccharides from Ophiopogon japonicus

HPGPC-ELSD法是一種平均相對(duì)分子質(zhì)量的相對(duì)測(cè)定方法。在測(cè)定過(guò)程中，需采用相對(duì)分子質(zhì)量已知的多糖對(duì)照品建立LogMw-VR標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算被測(cè)樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。然而，凝膠色譜分離是基于尺寸篩分離原理，樣品在色譜柱上的保留時(shí)間不僅與其相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，還與分子的空間結(jié)構(gòu)相關(guān)。相對(duì)分子質(zhì)量相同的線性結(jié)構(gòu)和球狀結(jié)構(gòu)分子，表觀尺寸差異很大，導(dǎo)致保留體積不同。可見(jiàn)，HPGPC-ELSD結(jié)果的準(zhǔn)確性主要取決于樣品和對(duì)照品在空間結(jié)構(gòu)上的相似性。采用HPGPC-ELSD法測(cè)定的麥冬多糖相對(duì)分子質(zhì)量結(jié)果較SECLALLS法小，是由于麥冬多糖樣品在水相的構(gòu)象介于球狀和無(wú)規(guī)卷曲之間，與葡聚糖標(biāo)樣空間結(jié)構(gòu)存在差異造成的。

MALDI-TOF-MS在檢測(cè)模式上有正、負(fù)離子檢測(cè)模式，多數(shù)情況下采用正離子檢測(cè)模式，因?yàn)樨?fù)離子模式下檢測(cè)效率相對(duì)較低。檢測(cè)方式有線性方式和反射方式兩種，線性方式受低分子的影響較大，其主要測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量大于10000 g/mol的物質(zhì)，當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量小于10000 g/mol時(shí)，采用反射方式。麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量分布在200～4000 g/mol之間，因此本試驗(yàn)在反射正離子模式下，對(duì)麥冬多糖相對(duì)分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行了測(cè)定。MALDI-TOF-MS的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果與其他方法相比明顯偏小，這可能是由于在低質(zhì)荷比區(qū)域質(zhì)譜圖受基質(zhì)干擾嚴(yán)重，且麥冬多糖的加合離子峰強(qiáng)度隨m/z的增大而降低，使計(jì)算得到的平均相對(duì)分子質(zhì)量偏低，分散系數(shù)增大。因此，MALDI-TOF-MS并不適合于測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量較小的多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量，但仍可以提供相對(duì)分子質(zhì)量分布信息。同時(shí)，MALDI-TOF-MS還能夠提供多糖的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元的相對(duì)分子質(zhì)量信息，用于推測(cè)其結(jié)構(gòu)、組成等。

SEC-LALLS可獲得樣品洗脫圖中每一洗脫體積點(diǎn)的相對(duì)分子質(zhì)量以及樣品的相對(duì)分子質(zhì)量分布。分子排阻色譜實(shí)現(xiàn)不同相對(duì)分子質(zhì)量高聚物分子的分離，分子按大小順序依次進(jìn)入激光光散射檢測(cè)器，通過(guò)Rayleigh光散射方程直接計(jì)算出相對(duì)分子質(zhì)量Mw、Mn、Mz和 Mp及相對(duì)分子質(zhì)量分布，不需要對(duì)照品對(duì)照以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該法操作簡(jiǎn)便，高效、誤差小。而且黏度檢測(cè)器還可以得到樣品在溶液中的結(jié)構(gòu)形態(tài)信息，包括流體力學(xué)體積Vh、流體力學(xué)半徑 Rh、以及Mark-Houwink曲線、Mark-Houwink曲線a值、K值。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，聚氧乙烯是窄相對(duì)分子質(zhì)量分布標(biāo)樣，用來(lái)建立方法(包括測(cè)定儀器常數(shù)和校正各檢測(cè)器之間的響應(yīng)時(shí)間);葡聚糖是寬相對(duì)分子質(zhì)量分布標(biāo)樣，用來(lái)驗(yàn)證聚氧乙烯建立的方法。dn/dc值(散射光角度和折光指數(shù)增量)與溶劑、樣品單體結(jié)構(gòu)、溫度等因素有關(guān)，與樣品相對(duì)分子質(zhì)量無(wú)關(guān)，可通過(guò)阿貝折光儀測(cè)定得到。麥冬多糖在水相的dn/dc值通常處于0.13～0.15之間，因此本實(shí)驗(yàn)用0.14計(jì)算。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPGPC-ELSD法、MALDI-TOF-MS法和SEC-LALLS法對(duì)麥冬多糖的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行了測(cè)定。HPGPC-ELSD法是一種相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)測(cè)定法，多糖相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性取決于樣品與對(duì)照品結(jié)構(gòu)的相似性。MALDI-TOF-MS法是一種相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定的絕對(duì)方法，無(wú)需對(duì)照品，但測(cè)得的麥冬多糖相對(duì)重均分子質(zhì)量誤差較大，該方法更適合用于多糖單元結(jié)構(gòu)等信息的獲取。SEC-LALLS法也是一種相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定的絕對(duì)方法，適合于多糖相對(duì)分子質(zhì)量及分布測(cè)定，還可以獲得樣品在溶液中的結(jié)構(gòu)形態(tài)信息，是一種較為理想的相對(duì)分子質(zhì)量及其結(jié)構(gòu)測(cè)定方法，但目前該儀器的普及率還不高。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果為多糖類化合物相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法的選擇提供了參考，也可為麥冬多糖藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

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