檸檬催化轉(zhuǎn)化原人參二醇組皂苷制備人參皂苷Rg5的初步研究

孫成鵬，高維平，趙寶中，成樂琴*

(1.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130024;2.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

人參Panax ginseng C.A.Meyer屬五加科草本植物，我國重要名貴藥材，其應(yīng)用有超過4000年的歷史［1］。人參皂苷是人參的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明，人參皂苷具有抗衰老、抗腫瘤、抗自由基、保護(hù)神經(jīng)和保護(hù)心血管等作用［2-9］。

人參皂苷Rg5最初從紅參中分離得到［10］，屬次級(jí)人參皂苷，是原人參二醇組皂苷(PPD)的代謝產(chǎn)物。人參皂苷Rg5具有抗接觸性皮炎［11］、抗腫瘤［12］、抑制環(huán)氧合酶-2［13］和改善肺部炎癥［14］等作用，特別在改善記憶力方面，其藥效遠(yuǎn)優(yōu)于人參皂苷 20(S)-Rg3 和 20(R)-Rg3［15］。由于人參皂苷Rg5的制備和分離難度較大［16］，在其制備過程中，生成副產(chǎn)物較多，如人參皂苷Rk1和Rz1，同時(shí)其分離僅可以通過制備型高效液相色譜和高速逆流來實(shí)現(xiàn)，故有關(guān)人參皂苷Rg5的制備及其藥理研究報(bào)道較少，目前，僅有炮制人參和專利［17］兩種方法，但上述方法產(chǎn)率很低，因此有必要開發(fā)人參皂苷Rg5的制備方法。

本實(shí)驗(yàn)選用生物質(zhì)材料檸檬為催化劑，PPD皂苷為原料，低成本環(huán)境友好地制備高附加稀有人參皂苷Rg5(圖1)，結(jié)合硅膠柱層析和半制備型高效液相色譜分離人參皂苷 Rg5和 Rk1，并通過HPLC、1H-NMR和13C-NMR進(jìn)行定量分析和結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料

人參皂苷對(duì)照品 Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、20(S)-Rg3和20(R)-Rg3購自成都曼斯特公司;PPD皂苷自制(純度為98.51%，其中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd的含有量分別為48.60%、19.11%、16.95%、4.72%和9.13%);人參皂苷對(duì)照品Rg5為自制(根據(jù)峰面積歸一化法測得其純度為99.33%);蒸餾水自制，乙醇、丙酮為分析純，乙腈和甲醇為色譜純。

圖1 人參皂苷Rg5的制備方案Fig.1 Method of preparation of ginsenoside Rg5

P230P型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司);JJ—1大功率電動(dòng)攪拌器(常州國華電器有限公司);DK—98—Ⅱ型恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法

2.1 稀有人參皂苷Rg5和Rk1的制備 向原人參二醇組皂苷溶液(20 mg/mL)中加入80%的檸檬汁水溶液(1∶2.5，V∶V)，于100℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)飽和碳酸鈉中和后，用水飽和正丁醇萃取5次，合并有機(jī)層，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干。殘留物甲醇溶解(4 mL)，0.45μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC定量分析。

2.2 稀有人參皂苷Rg5和Rk1的分離 將上述反應(yīng)產(chǎn)物做成樣品膠，以三氯甲烷-甲醇為洗脫劑(8.5∶1.5，V/V)，利用硅膠柱層析分離得到人參皂苷Rg5、Rk1和Rz1的混合物。將上述混合物溶于甲醇，經(jīng)半制備型高效液相色譜 ［Hypersil C18，250 mm×20 mm，10μm，乙腈-水(39 ∶61)，15 mL/min］分離得到三個(gè)餾分，分別為化合物1(27.5 mg)、2(18 mg)以及2和3的混合物(20.5 mg)。

2.3 HPLC分析

2.3.1 有機(jī)酸測定 將檸檬用榨汁機(jī)榨成汁，冷凍殺菌，放置于冰箱內(nèi)儲(chǔ)存。取1 mL檸檬汁加入蒸發(fā)皿中，于70℃蒸干。殘留物用80%乙醇溶解(8 mL)，經(jīng)離心和濾膜(0.45μm)過濾，用于HPLC分析。Damonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，二極管陣列檢測器，進(jìn)樣量 20μL，柱溫30℃，體積流量 0.8 mL/min。流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液。HPLC分析結(jié)果，見圖2。

圖2 檸檬中有機(jī)酸HPLC譜圖Fig.2 HPLC analyses of organic acids in lemon

由圖2可知，檸檬中主要含有檸檬酸和蘋果酸，且檸檬酸的量遠(yuǎn)大于蘋果酸。HPLC定量分析表明，檸檬中蘋果酸的量為0.14 mg/mL，檸檬酸的量為20.20 mg/mL，其含有量為蘋果酸的144倍，且檸檬的pH為2.46，酸性較強(qiáng)，因此，可用其代替?zhèn)鹘y(tǒng)HCl、H2SO4和HAc等催化劑，用于人參皂苷Rg5的制備。

2.3.2 反應(yīng)產(chǎn)物測定 YMC J'sphere ODS-H80色譜柱(4.6 mm×250 mm，4μm)，UV檢測器，檢測波長為203 nm，進(jìn)樣量20μL，柱溫30℃，體積流量1 mL/min。流動(dòng)相A為乙腈，B為水。梯度洗脫程序:0～30 min，30% ～40%A;30～37 min，40% ～50%A;37～45 min，50% ～51%A;45～60 min，51% ～55%A;60～60.10 min，55% ～90%A;60.10～75 min，90%A;75～75.10 min，90% ～30%A。HPLC分析結(jié)果，見圖3。

圖3 人參皂苷對(duì)照品(A)和反應(yīng)產(chǎn)物(B)的局部HPLC譜圖Fig.3 HPLC profile analysis of refer ginsenosides(A)and reaction product(B)

圖3-A為人參皂苷對(duì)照品的HPLC分析圖，人參皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3和Rg5的保留時(shí)間分別出現(xiàn)在16.3、18.2、 20.2、 21.1、 25.2、 43.5、 44.4、 58.2 min。圖3-B為反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析圖，與圖3-A相比，保留時(shí)間在15 min～28 min之間沒有出現(xiàn)任何信號(hào)峰，說明原料人參皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd均已完全轉(zhuǎn)化。由圖3-A可知，人參皂苷Rg5的信號(hào)峰出現(xiàn)在保留時(shí)間58.2 min，圖3-B中，保留時(shí)間在56.4 min處出現(xiàn)的信號(hào)峰，推測為人參皂苷 Rk1與 Rz1［18］混合物，而保留時(shí)間58.3 min出現(xiàn)的信號(hào)峰可以認(rèn)定為人參皂苷Rg5，對(duì)其定量分析結(jié)果表明，收率為30.77%，得率為21.53%。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

將化合物1和2溶于氘代吡啶，采用BRUKER AVANCEⅡ核磁共振儀(Switzerland，500 MHz)測定上述兩種化合物的1H-NMR和13C-NMR。

化合物1:白色粉末(乙腈);1H-NMR(pyridine-d5，500MHz) δ:0.85(3H， s，-CH3)，0.99(3H， s，-CH3)，1.05(3H， s，-CH3)，1.13(3H， s，-CH3)，1.32(3H， s，-CH3)，1.61(3H， s，-CH3)，1.65(3H， s，-CH3)，1.84(3H，s，-CH3)，3.31(1H，dd，J=4.0 Hz，C3-H)，3.94(1H，s，C12-H)，4.94(1 H，d，J=7.5 Hz，C1'-H)，5.38(1 H，d，J=7.5 Hz，C1″-H)，5.25(1H，t，C24-H)，5.53(1H，t，C22-H);13C-NMR結(jié)果見表1。

化合物2:白色粉末(乙腈);1H-NMR(pyridine-d5，500MHz) δ:0.83(3H， s，-CH3)，0.98(3H， s，-CH3)，1.03(3H， s，-CH3)，1.13(3H， s，-CH3)，1.32(3H， s，-CH3)，1.61(3H， s，-CH3)，1.68(3H， s，-CH3)，3.31(1H，dd，J=4.0 Hz，C3-H)，3.94(1H，s，C12-H)，4.96(1H，d，J=7.5 Hz，C1'-H)，5.41(1 H，d，J=7.5 Hz，C1″-H)，4.93(1H，s，C21-H)，5.17(1H，s，C21-H)，5.30(1H，t，C24-H);13C-NMR結(jié)果見表1。

在化合物1的1H-NMR中，δ 0.85～1.84分別出現(xiàn)了C-19、C-30、C-18、C-29、C-28、C-27、C-26和C-21的8個(gè)-CH3氫信號(hào)峰，δ 5.25和5.53分別為C-24和C-22的雙鍵氫的信號(hào)峰。在化合物1的13C-NMR中，共出現(xiàn)42個(gè)碳信號(hào)峰，其中 δ 105.44和106.37為兩個(gè)糖端基碳信號(hào)峰，δ 140.54、123.65、124.05和 131.62分別為 C-20、C-22、C-24和C-25的雙鍵碳信號(hào)峰，而其他1HNMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn) ［19］基本一致，故化合物1鑒定為人參皂苷Rg5。

化合物2是在制備人參皂苷Rg5過程中副產(chǎn)的次級(jí)人參皂苷，其1H-NMR的數(shù)據(jù)與化合物1基本相似，只是在δ 0.83～1.68之間只有7個(gè)-CH3氫信號(hào)峰，分屬于 C-19、C-30、C-18、C-29、C-28、C-27和C-26的-CH3的氫。此外，由于C-21雙鍵碳上亞甲基的兩個(gè)氫所處化學(xué)環(huán)境不同，存在有兩個(gè)信號(hào)峰，分別在δ 4.93和5.17;另一個(gè)雙鍵碳(C-24)的氫信號(hào)峰出現(xiàn)在δ 5.30。在化合物2的13C-NMR中，化合物2的C-20、C-21和C-22與化合物1存在著明顯不同，其信號(hào)峰分別出現(xiàn)在δ155.91，108.48和 34.24?；衔?2的其他1HNMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［19］基本一致，故化合物2鑒定為人參皂苷Rk1。

4 人參皂苷Rg5的反應(yīng)機(jī)理

從圖4可以看出，PPD轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg5的途徑為PPD→Rg3→Rg5，同時(shí)生成副產(chǎn)物人參皂苷Rk1和Rz1。PPD皂苷在酸性條件下，首先生成人參皂苷Rg3，再進(jìn)一步脫水生成人參皂苷Rg5及其副產(chǎn)物。由于人參皂苷Rg3在水中溶解度很低進(jìn)而形成沉淀，阻礙了人參皂苷Rg3進(jìn)一步脫水。此外，人參皂苷Rg3在脫水過程中，存在著3種不同的脫水方式，分別生成人參皂苷Rg5(脫水方式符合扎伊切夫規(guī)則，E-構(gòu)型)，人參皂苷 Rk1(脫水方式符合霍夫曼規(guī)則)和Rz1(脫水方式符合扎伊切夫規(guī)則，Z-構(gòu)型，與人參皂苷Rg5屬于順反異構(gòu)體)。然而，在上述3種產(chǎn)物中，由于人參皂苷Rg5的脫水方式符合扎伊切夫規(guī)則，同時(shí)其構(gòu)型為E-構(gòu)型，屬于優(yōu)勢構(gòu)象，故其在3種產(chǎn)物中產(chǎn)率較高。從上述分析結(jié)果可以看出，若能提高中間產(chǎn)物人參皂苷Rg3溶解度和其脫水的選擇性，人參皂苷Rg5的收率勢必將有質(zhì)的提高。

圖4 人參皂苷Rg5的反應(yīng)機(jī)理Fig.4 Reaction mechanism of ginsenoside Rg5

5 結(jié)論

稀有人參皂苷Rg5為PPD皂苷的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在抗腫瘤、改善記憶力和抗接觸性皮炎等方面療效顯著。由于人參皂苷Rg5的中間體人參皂苷Rg3在水中溶解度較小，而給其制備帶來了一定的難度，故有關(guān)人參皂苷Rg5制備及藥理活性研究報(bào)道較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPD皂苷溶液經(jīng)檸檬汁處理，人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和 Rd的轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，人參皂苷Rg5收率為30.77%，得率為21.53%。與專利方法［17］相比，人參皂苷Rg5的制備不需任何氣體(氮?dú)?保護(hù)，操作簡單，反應(yīng)時(shí)間短，相對(duì)于專利縮短了22 h，同時(shí)其得率提高了6.83%。這對(duì)于研究人參皂苷Rg5的藥理活性及開發(fā)相關(guān)保健品具有重要參考價(jià)值。

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