蜘蛛香野生轉家種品質評價研究

郜紅利，譚玉柱

(1.湖北民族學院，湖北恩施 445000;2.成都中醫藥大學，四川成都 611137)

蜘蛛香為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖和根［1］。性味辛、苦，溫，具有理氣和中、散寒除濕、活血消腫的功效，主要用于治療脘腹脹痛、嘔吐泄瀉、風寒濕痹、小兒疳積、腳氣水腫、跌打損傷等癥［2］。其化學成分主要是揮發油、環烯醚萜、黃酮及其他一些成分［3］。現代藥理研究表明，蜘蛛香有鎮靜、催眠、抗焦慮、抗腫瘤等藥理作用［4］。蜘蛛香主要分布在云南、湖北、貴州等偏遠山區［5］，其中湖北恩施自治州各縣市資源豐富。隨著蜘蛛香藥用價值的日益提高，其野生資源已難以滿足市場需求，開展野生蜘蛛香轉家種的研究迫在眉睫［6］，本課題組通過其根莖無性繁殖，對其野生轉家種技術進行初步研究，培育了不同生長年限的栽培品，從其產量及外觀性狀上觀察，二者并無較大差異，但是有關其栽培品的品質評價尚無定論。因此，課題組分別收集不同栽培年限的蜘蛛香與野生蜘蛛香，從其性狀、鑒別、化學成分分析、指標性成分定量測定等方面進行質量評價，以期對野生品種與栽培品種進行科學評價，探討野生轉家種的可行性，也為蜘蛛香栽培技術的推廣應用提供技術支持。

1 試劑與試藥

1.1 儀器與試劑 Angenlent 1200高效液相色譜儀;BP121S型電子天平(北京Sartorius天平有限公司，十萬分之一);顯微鏡(上海炳宇光學儀器有限公司)，DiamonsilC-18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)。纈草三酯(純度＞98%，成都植標化純生物科技有限公司，110756-200110)、橙皮苷(純度＞98%，中國藥品生物制品檢定研究院，110721-200512)，乙腈、甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，超純水(實驗室自制)，其余試劑均為分析純。

1.2 藥材 實驗用蜘蛛香藥材分別來自湖北省恩施州利川市、宣恩縣、巴東縣、咸豐縣、建始縣等5個縣市，每個縣市各有栽培品與野生1個批次，共計10個批次，野生與栽培品經中藥鑒定教研室朱敏英教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖和根，來源見表1。

表1 不同批次蜘蛛香藥材來源Tab.1 Sources of different batches of Valeriana jatamansi

2 方法與結果

2.1 性狀

2.1.1 野生品 本品根莖呈圓形或扁圓形，略彎曲，不分叉，長3～5 cm，直徑為0.5～1.6 cm，棕褐色或茶褐色，表面有綢密的環紋突起，不甚規則，底面有須根痕。蘆頭平截，可見莖、葉殘基。質堅實，斷面黃褐色。下側具多數須根，多卷縮彎曲。味略苦、辛質堅脆，易折斷，斷面淺綠色。

2.1.2 栽培品 本品根莖呈扁圓柱形，略彎曲，不分叉，長2～6 cm，直徑為0.6～1.7 cm，莖基殘穴處稍膨大，表面褐色，表面有較綢密的環紋突起，不甚規則，底面有多數須根痕，須根多卷縮彎曲。味略苦、辛，質堅脆，易折斷，斷面淺綠色。栽培品種主要特點:個頭較野生品大、顏色較淺、莖基殘穴處膨大、底面須根甚多。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別 野生與栽培品一致。本品粉末灰褐色，置顯微鏡下觀察發現淀粉粒眾多，類圓形，臍點裂縫狀，有的可見層紋;復粒由2～4粒組成。易見含黃棕色內含物與油滴的薄壁細胞碎片。根毛為單細胞與多細胞組成。木栓細胞淡黃色，多角形。導管多為網紋導管和單紋孔導管。薄壁細胞內含有橙皮苷結晶和淡棕褐色物。

2.2.2 TLC鑒別 分別取本品野生與栽培品粉末1 g，加乙醚10 mL，振搖，放置5 min，濾過，濾液揮去乙醚，殘渣加甲醇0.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取纈草三酯對照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的對照溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液5μL、對照品溶液2μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(30～60℃)-丙酮(5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。野生品與栽培品顯色斑點沒有明顯差異。

2.3 化學成分比較

2.3.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，0～20 min，10% ～55%乙腈，20～60 min，55% ～95%乙腈。體積流量0.8 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。

2.3.2 色譜結果 見圖1。圖1中的12號峰(纈草三酯)為參照峰，野生品與栽培品化學成分比較沒有明顯差異，根據特征圖譜共有峰標記，顯著差異峰主要集中在3、4號峰，根據極性較大的黃酮類成分與極性較小的環烯醚萜類成分主要集中在圖譜的首尾段，觀察發現野生品與栽培品在首尾段無顯著差異，說明影響其藥效的主要化學成分一致，主要差異集中在中間段。

圖1 野生品與栽培品的化學成分對照圖譜Fig.1 Fingerprint of wild and cultivated products of Valeriana jatamansi Jones

2.4 成分測定

2.4.1 纈草三酯含有量比較

2.4.1.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水(60∶40)為流動相;檢測波長為256 nm。理論板數按纈草三酯峰計算應不低于5000。

2.4.1.2 對照品溶液的制備 取纈草三酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含纈草三酯0.1096 mg的溶液，即得。

2.4.1.3 供試品溶液的制備 分別取野生與栽培品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理(功率500 W，頻率28 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4.1.4 線性關系考察 分別精密吸取纈草三酯對照品2、5、10、15、20μL注入液相色譜儀，按照2.4.1.1項色譜條件下檢測峰面積，同一進樣體積連續測3次取平均峰面積，以進樣量為橫坐標x，以平均峰面積為縱坐標y進行線性回歸，即得線性關系為y=194.09x+12.729，r=0.9996，線性范圍為 0.2192 ～2.192μg。

2.4.1.5 精密度考察 取同一份對照品溶液，按2.4.1.1項中色譜條件，連續進樣5次，計算纈草三酯峰面積RSD為2.34%(n=5)。

2.4.1.6 穩定性考察 將“批次1”供試品溶液室溫下放置，分別于第0、2、4、6、8、12 h進樣測定，計算纈草三酯色譜峰峰面積RSD值為2.40%(n=5)，表明纈草三酯在12 h內穩定。

2.4.1.7 加樣回收率試驗 分別稱取6份供試品約0.5 g，加入與“批次1”供試品纈草三酯含有量相當的同一對照品溶液，分別制備6份樣品。分別測定，平均加樣回收率為100.93%，RSD為3.37%(n=6)。

2.4.1.8 樣品測定 稱取不同來源的野生品與不同生長年限的栽培品蜘蛛香藥材粉末各2 g，按照2.4.1.3項下供試品制備方法制備，依次進樣10μL，按照2.4.1.1項色譜條件測定各供試品峰面積，外標法計算。圖譜見圖2。

圖2 纈草三酯HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of valepotriate

2.4.2 總黃酮與總纈草三酯量比較

2.4.2.1 標準曲線的制定 準確稱取橙皮苷和纈草三酯對照品適量，分別加甲醇溶解配制成質量濃度為0.1106 mg/mL和0.1096 mg/mL的標準溶液。分別移取上述標準液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以甲醇作空白，分別于最大吸收波長284 nm和256 nm處測吸光度。以吸光度A對標準溶液質量濃度C作圖，即得標準工作曲線分別為Y=0.035x－0.006，r=0.9993，線性范圍為 5.53～27.65μg/mL;Y=31.427x+0.0372，r=0.9992;線性范圍為2.19 ～27.4μg/mL。

2.4.2.2 供試品的制備及測定 分別稱取2 g已脫脂和未脫脂處理的野生和栽培蜘蛛香粉末各3批次，分別加入50 mL甲醇溶劑，密塞，搖勻，超聲提取1次，30 min/次，取出放冷，離心分離，取上清液于旋轉蒸發器上濃縮至干，加30 mL甲醇溶解，濾去不溶物，濾液加甲醇定容至50 mL，即得總黃酮和纈草三酯供試品溶液。分別移取0.2 mL供試品溶液，加甲醇定容至10 mL，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處測吸光度。并根據標準曲線計算蜘蛛香總黃酮和纈草三酯量。

2.4.2.3 精密度考察 取橙皮苷和纈草三酯對照品適量，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處測吸光度，連續測定5次，計算橙皮苷和纈草三酯RSD分別為3.14%和2.89%(n=5)。

2.4.2.4 穩定性考察 將橙皮苷和纈草三酯對照品溶液室溫下放置0、2、4、6 h，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處計算橙皮苷和纈草三酯對照品吸光度的RSD值，分別為1.98%和1.87%(n=4)，表明橙皮苷和纈草三酯在6 h內穩定。

2.4.2.5 加樣回收試驗 稱取“批次1”已知總黃酮和總纈草三酯含有量的蜘蛛香供試品6份，分別加入等量的橙皮苷和纈草三酯對照品，以甲醇作空白，分別于284 nm和256 nm處測吸光度，計算平均加樣回收率分別為96.31%和95.74%，RSD分別為3.34%和3.21%(n=6)。

2.4.3 測定結果 見表2。

表2 蜘蛛香野生品與栽培品指標性成分含有量比較Tab.2 Content determination of wild and cultivated products of Valeriana jatamansi

綜上，蜘蛛香栽培品的總黃酮、纈草三酯類成分含有量均高于野生品。

3 結論

3.1 野生蜘蛛香與栽培蜘蛛香的外觀性狀無明顯差異，顯微和薄層鑒別亦未發現明顯差異，其特征化學成分分析共有峰均存在，僅在中間段3、4號共有峰上有明顯不同，提示野生品較栽培品化學成分復雜，但是差異成分是否是其活性成分還有待商榷;野生品與栽培品的指標性成分含有量比較發現，總黃酮和纈草三酯量后者均高于前者。綜上，蜘蛛香栽培品品質在指標性成分含有量上優于野生品。

3.2 蜘蛛香總黃酮是其抑菌、抗腫瘤作用的主要藥效成分［7］，橙皮苷是蜘蛛香黃酮類的主要化學成分［8］，利用它作為標準測定總黃酮不僅測定準確而且具有衡量其質量的意義，已有研究表明家種蜘蛛香中橙皮苷量較野生蜘蛛香高，提示其野生轉家種的可行性［9］。纈草三酯類成分具有抗腫瘤、鎮靜催眠、抗焦慮、解痙等多種藥理活性［10］，是其主要活性成分及質量控制指標［11］，蜘蛛香中纈草三酯類成分量的測定方法主要有電位滴定法［12］、比色法［13］、酸堿滴定法［14］。利用紫外分光光度法測定蜘蛛香中總纈草三酯量，方法準確、快速、重復性好、操作簡便［7］。蜘蛛香藥材集中九月采集，主要是考慮纈草三酯類成分在九月藥材中含有量較高［15］。本課題基于性狀鑒別、化學成分比較、指標性成分量比較等方面對蜘蛛香野生品與栽培品品質進行系統評價，為蜘蛛香野生轉家種品質評控提供重要科學依據，證實了野生轉家種的可行性，同時該項目的開展將極大緩解其資源匱乏的現狀，有效保護蜘蛛香野生資源，有利于中藥資源的可持續開發利用。

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