淫羊藿炮制前后在大鼠體內的藥代動力學研究

周一帆，胡昌江，張雪潔，余凌英，陳 琳，高 源

(成都中醫藥大學藥學院，四川成都 611137)

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim的干燥葉，始載于《神農本草經》，具有補腎陽，強筋骨，祛風濕的功效［1］。羊脂油炙淫羊藿，最早記載于《雷公炮炙論》［2］，為臨床常用的炮制品。淫羊藿生品功效側重于祛風濕，而經羊脂油炙后功效側重于溫腎壯陽。黃酮類化合物是淫羊藿的有效成分，其中以淫羊藿苷為主的多種以異戊烯基黃酮為母核的結構類似化合物為其主要成分。藥物在體內的代謝過程在一定程度上對藥效有影響［3-7］。本實驗旨在通過比較生、炙淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內的代謝過程的差異，為系統性的研究淫羊藿炮制前后功效變化奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(美國Agilent，型號1200)，單四級桿質譜(美國Agilent，型號6120)電子天平(德國SARTORIUS，型號BD61，感量為0.1 mg);高速離心機(上海安亭科學儀器廠，型號TGL-16B)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110737-200415，供含量測定);槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號081-9033，供含量測定)。淫羊藿藥材(購于成都新荷花藥材市場)，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim干燥葉;乙腈(色譜純，美國sigma公司)，其余試劑為分析純;水為超純水。

1.3 實驗動物 SD大鼠，清潔級，雄性，體質量(220±10)g，購于四川達碩實驗動物中心，動物合格證號SCXK(川)2008—24。

2 方法與結果

2.1 淫羊藿藥液的制備 炙淫羊藿由實驗室自行炮制(炮制溫度為160℃，炮制時間7 min，每100 g淫羊藿加羊脂油20 g)［8］，生、炙淫羊藿經高效液相檢測淫羊藿苷量為1.12%和1.29%。取生淫羊藿173 g、炙淫羊藿150 g分別12倍70%乙醇回流提取兩次，每次1.5h。藥液減壓濃縮至100 mL［9］。生淫羊藿藥液質量濃度1.73 g/mL(相當于淫羊藿苷19.37 mg/mL)，炙淫羊藿藥液質量濃度1.50 mg/mL(相當于淫羊藿苷19.35 mg/mL)。

2.2 血漿樣品處理［10-12］分別取血漿0.2 mL置1.5 mL離心管中，加入適量內標溶液1 mL乙酸乙酯渦旋混合5 min，離心10 min(8000 r/min)，取上清液。殘渣再加入1 mL乙酸乙酯重復操作一次，合并兩次上清液。置于40℃下氮氣吹干后加入200μL甲醇，渦旋混合 5 min，離心 10 min(12000 r/min)，吸取上清液進樣分析。

2.3 分析方法的建立

2.3.1 色譜條件 Diamonsil鉆石二代C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);以乙腈－0.1%甲酸溶液(30∶70)為流動相;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃。

2.3.2 質譜檢測條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，干燥器流量12 L/min，溫度350℃，SIM模式下選擇質荷比(m/z)677與303離子進行檢測。

2.3.3 對照品及內標物溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品加甲醇配置成0.418 mg/mL的貯備液，精密稱取槲皮素對照品加甲醇配置成1.54μg/mL的貯備液，備用。

2.3.4 專屬性考察 將空白血漿、空白血漿中加入淫羊藿苷及給藥后大鼠血漿樣品按照2.3項下血漿樣品處理方法處理后進行測定。結果顯示在選定的條件下，空白血漿中的內源性物質對淫羊藿苷的測定無干擾，見圖1。

2.3.5 標準曲線的繪制 精密吸取0.418 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液適量，用空白大鼠血漿分別配 置 成 0.209、0.418、0.836、1.672、2.508、3.344μg/mL的系列空白血漿對照品溶液200μL，依照2.2項下方法處理樣品后進樣分析，以質量濃度(μg/mL)為縱坐標Y，淫羊藿苷與內標物峰面積比為橫坐標X，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y=1.6142 X+0.0871，r2=0.9996。結果表明淫羊藿苷在0.209～3.344μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.6 精密度與回收率試驗 取淫羊藿苷貯備液，加入空白大鼠血漿配制成含質量濃度分別為0.3、1.5、3.0μg/mL的血漿樣品，依照2.2項下方法操作與測定，每一濃度平行測定5次，每一質量濃度連續測定5 d。計算日內精密度和日間精密度。另外，將血漿樣品測得的濃度與血漿實際濃度比較，計算相對回收率。結果顯示高、中、低濃度血漿中淫羊藿苷日內精密度RSD分別為5.16%、5.58%、4.87%;日間精密度RSD分別為6.59%、5.53%、4.83%。高、中、低濃度血漿中淫羊藿苷平均回收率為88.4%、93.1%、85.6%。

2.4 大鼠藥代動力學試驗 取雄性SD大鼠12只，隨機分兩組，分別按體質量灌胃給予生淫羊藿藥液(34.6 g/kg)、炙淫羊藿藥液(30 g/kg)，相當于淫羊藿苷387 mg/kg。實驗前12 h禁食，自由飲水。在給藥前及給藥后 5、15、30、60、90、120、240、360、480、720 min分別后眼眶靜脈叢取血0.5 mL，置于預先肝素化的離心管中，6000 r/min離心10 min，取上層血漿0.2 mL放入－20℃冰箱保存備用。

2.5 數據處理 使用DAS 2.0軟件處理大鼠灌胃后各時間點的平均血藥濃度(C)－時間(t)數據，自動判別模型計算藥代動力學參數。DAS 2.0軟件計算得藥代動力學參數見表1，大鼠血漿中淫羊藿苷的血藥濃度-時間曲線見圖2。

表1 生、炙淫羊藿藥代動力學參數(，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of icariin in extract from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium(，n=6)

表1 生、炙淫羊藿藥代動力學參數(，n=6)Tab.1 Main pharmacokinetic parameters of icariin in extract from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium(，n=6)

注:*與對照藥物相比P＜0.05

參數 單位 藥物生淫羊藿 炙淫羊藿Tmax h 11 Cmax mg/L 2.285±0.75 2.8±0.82*t1/2α h 0.691±0.12 4.569±0.89 t1/2β h 4.967±0.56 5.423±0.57 V1/F L/kg 112.504±10.53 130.42±15.88 CL/F L/h/kg 23.4±6.14 15.6±3.76 AUC(0-t) mg/L·h 14.935±5.11 20.682±4.28*AUC(0-∞) mg/L·h 16.039±6.21 25.301±8.12 MRT(0-t) h 4.932±0.76 5.471±1.21 MRT(0-∞) h 6.093±0.84 9.1±2.36 Ka 1/h 1.38±0.19 1.98±0.24

圖2 生、炙淫羊藿的血藥濃度-時間曲線Fig.2 Concentration-time profiles of icariin in extract solutions from Epimedii Folium and processed Epimedii Folium

3 討論

本實驗對于血漿處理方法進行了考察，血漿處理的溶劑分別比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯處理后淫羊藿苷的回收率，最終乙酸乙酯處理后的回收率較高。血漿處理次數的比較顯示，處理2次的回收率均高于處理1次，而處理3次與處理2次的回收率差異不大。氮吹溫度的考察顯示30、40、50℃回收率無明顯的差異。血漿處理方法最后定為用乙酸乙酯處理2次后置于40℃下氮氣吹干。

藥時曲線經擬合顯示生、炙淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內藥代動力學均符合二室模型。在表1與圖2中可以看出，生淫羊藿組血藥峰濃度(Cmax)為(2.29±0.75)mg/L，0～12 h的藥時曲線下面積(AUC0-t)為(14.935±5.11)mg/(L·h)，炙淫羊藿組 Cmax升高到(2.80±0.82)mg/L，AUC(0-t)升高到(25.301±8.12)mg/(L·h)。由此可見炙淫羊藿中的淫羊藿苷在大鼠體內的吸收量有所提高，表明了炮制對于淫羊藿中淫羊藿苷在大鼠體內的吸收有一定的促進作用，炮制可提高淫羊藿中淫羊藿苷的生物利用度。淫羊藿炮制所用輔料羊脂油主要含飽和脂肪酸7種，主要是棕櫚酸及硬脂酸等，不飽和脂酸9種主要是油酸，反式9-十八碳烯酸等［13-14］。脂肪酸有表明活性劑的作用可能是淫羊藿苷溶解性得到提高，從而增強了其在體內的吸收。

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