泰山白花丹參提取物體外對氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞作用的研究

焦 鵬，楊娜娜，崔英杰，秦樹存

(泰山醫(yī)學(xué)院動脈粥樣硬化研究所，山東泰安 271000)

內(nèi)皮祖細(xì)胞參與的內(nèi)皮系統(tǒng)損傷的修復(fù)是動脈粥樣硬化的始動因素和重要環(huán)節(jié)［1-2］。氧化應(yīng)激和炎癥是動脈粥樣硬化發(fā)展的兩個關(guān)鍵成分，同時活性氧是動脈粥樣硬化炎癥發(fā)生的始動因素［3］。前期實驗證實，泰山白花丹參提取物對H2O2損傷后內(nèi)皮祖細(xì)胞有顯著保護(hù)作用，但其具體機制尚不是很明確。本實驗擬從氧化應(yīng)激和炎癥方面探討泰山白花丹參提取物對內(nèi)皮祖細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞 內(nèi)皮祖細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定本課題組已成功完成［4-5］，在本院生命科學(xué)研究中心細(xì)胞培養(yǎng)間常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑與藥品 白花丹參(產(chǎn)自泰山)由山東大學(xué)博士生導(dǎo)師夏作理教授鑒定，白花丹參提取物的制備參見參考文獻(xiàn)［4-5］;EBM—2培養(yǎng)基購自Lonza公司;人淋巴細(xì)胞分離液購自天津TBD公司;DiI-Ac-LDL，F(xiàn)ITC-UEA-I購自BTI公司;人纖維連接蛋白，PE-VEGFR-2，PE-CyTM5-CD34購自美國BD公司;超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;人用IL-6 ELISA試劑盒和人用TNF-α ELISA試劑盒均購自深圳市達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;二氯熒光素二乙酯(DCFH-DA)購自Sigma。

1.3 儀器 BD FACScalibur流式細(xì)胞儀，美國 BD公司;LG 16—W高速微量離心機，北京醫(yī)用離心機廠;BIO—RAD Model 550酶標(biāo)儀，日本;MCO—15AC CO2培養(yǎng)箱，日本三洋株式會社。

2 方法

2.1 實驗分組 內(nèi)皮祖細(xì)胞原代培養(yǎng)7 d后，以0.25%胰酶將各孔細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液，以同等數(shù)量細(xì)胞接種隨機分為正常對照組、H2O2損傷組(0.001%H2O2)、白花丹參+H2O2組(白花丹參質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.8 g/L，每組同時加0.001%H2O2)，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。

2.2 ELISA方法檢測培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平 分組處理細(xì)胞后收集培養(yǎng)液上清，離心15 min，取上清，按照試劑盒說明書中實驗步驟操作，吸光度值于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定，根據(jù)預(yù)實驗所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本的濃度。

2.3 黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶(SOD)活力收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，按試劑盒說明書加好各試劑后，混勻，室溫放置10 min，于波長550 nm處，1 cm光徑比色杯，蒸餾水調(diào)零，測各組吸光度值，實驗每組重復(fù)測一次。根據(jù)吸光度值計算總SOD活力。

2.4 細(xì)胞活性氧水平檢測 將細(xì)胞以相同密度接種于6孔培養(yǎng)板，過夜，按不同分組處理完后，吸棄培養(yǎng)液加入1∶1000用無血清培養(yǎng)液稀釋的 DCFH-DA(終濃度為10μmol/L)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。PBS洗滌3次后，胰酶消化，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀488 nm激發(fā)下檢測FL1通道熒光。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的檢測 與正常對照組相比，過氧化氫損傷后顯著升高了內(nèi)皮祖細(xì)胞上清液的IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度(P＜0.01)，白花丹參提取物干預(yù)后，與單純損傷組相比降低了IL-6和TNF-α，各質(zhì)量濃度白花丹參組與單純損傷組相比有顯著性差異(表1)。

表1 培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度變化()

表1 培養(yǎng)上清中IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度變化()

注:與正常對照組比較，*P＜0.01;與H2O2損傷組比較 ，#P＜0.01(圖1同)

組 別 IL-6/(ng·L－1) TNF-α/(ng·L－1)60.43±12.89 49.18±14.14 H2O2損傷組 189.56±13.59* 232.34±25.89*0.2g/L白花丹參+H2O2 70.65±9.18# 49.45±10.09#0.4 g/L白花丹參+H2O2 51.19±10.24# 33.2±8.48#0.8 g/L白花丹參+H2O2 40.14±10.67# 38.8±6.98正常對照組#

3.2 白花丹參對氧化損傷后細(xì)胞總超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響 0.001%H2O2作用內(nèi)皮祖細(xì)胞后，總超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯下降，而在0.2、0.4和0.8 g/L白花丹參共同作用下，SOD活性比損傷組有了顯著的改善(圖1)。

圖1 各組別SOD活力測定

圖2 各組別活性氧水平測定

3.3 各組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化 流式檢測結(jié)果表明損傷組細(xì)胞內(nèi)FL1平均熒光強度明顯高于對照組，說明過氧化氫損傷后細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生明顯升高，0.2 g/L白花丹參組與過氧化氫損傷組比較差別不大，而0.4 g/L和0.8 g/L白花丹參質(zhì)量濃度組活性氧水平與過氧化氫損傷組比較明顯降低(P＜0.05)，見圖2。

4 討論

目前，世界范圍內(nèi)心血管疾病的發(fā)病率和死亡率都在逐年上升，動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是主要的病理基礎(chǔ)［6-7］。AS是多因素所致病變，主要有血管內(nèi)皮功能障礙、炎癥、氧化應(yīng)激等［8］。眾所周知，AS屬慢性炎癥增殖性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿于動脈粥樣硬化的全過程，細(xì)胞因子及氧化應(yīng)激產(chǎn)物在炎癥反應(yīng)中起重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及功能紊亂是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)，并貫穿于AS進(jìn)展的全過程，因此靶向修復(fù)血管內(nèi)皮，糾正內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，可有效抑制AS的形成和發(fā)展［9-12］。由于成熟內(nèi)皮細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，修復(fù)受損內(nèi)皮的能力有限。近年來諸多研究表明血管內(nèi)皮細(xì)胞外的干細(xì)胞可修復(fù)血管大面積創(chuàng)傷，因而提出了內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)修復(fù)假說［13-14］。由于在一些疾病狀態(tài)下，EPC的數(shù)量和功能都有所降低，那么是否可以人為地恢復(fù)和增強病理狀態(tài)下內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)活性和功能就成為目前研究的熱點。

超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物體內(nèi)的一種內(nèi)生性氧自由基清除劑，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。SOD活力水平是公認(rèn)的可間接反映機體內(nèi)自由基水平的重要指標(biāo)之一，它與自由基水平呈負(fù)相關(guān)。而MDA的量常常可反映脂質(zhì)過氧化的程度，間接的反映出細(xì)胞損傷的程度。活性氧具有較強的氧化作用，在有機體中少量活性氧的存在并不會造成明顯的氧化損傷，目前研究表明細(xì)胞內(nèi)的活性氧參與了凋亡的過程。當(dāng)細(xì)胞受到一些因素刺激時，通過細(xì)胞膜上NADPH氧化酶系統(tǒng)作用產(chǎn)生大量活性氧。過多的活性氧會引起DNA損傷、脂質(zhì)過氧化而觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡［15］。目前普遍認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，IL-6、TNF-α兩者在炎癥反應(yīng)急性相中聯(lián)系緊密，IL-6是預(yù)測心血管事件的獨立危險因子［16］。

本課題組前期實驗證實，白花丹參能改善H2O2引起的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖抑制和凋亡增加的現(xiàn)象。本實驗主要對這一現(xiàn)象的機理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)過氧化氫刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞后，炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌有顯著性升高，SOD活力明顯下降而且細(xì)胞內(nèi)活性氧明顯增加，而白花丹參干預(yù)后，這些癥狀都有明顯改善，說明白花丹參提取物對內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷影響的機制可能是提高了該細(xì)胞的抗氧化酶活性、降低了炎癥因子的釋放并且清除了細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧。

［1］周曉峰，王 佐.內(nèi)皮祖細(xì)胞在動脈粥樣硬化進(jìn)程中的作用［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15(12):940-942.

［2］張美華，張 偉，蓋 凌，等.血管內(nèi)皮祖細(xì)胞在治療動脈粥樣硬化中的作用［J］.中國心血管雜志，2012，17(1):73-75.

［3］陳 瑗，周 玫.氧化應(yīng)激-炎癥在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中作用研究的新進(jìn)展［J］.中國動脈硬化雜志，2008，16(10):757-762.

［4］焦 鵬，常 起，陳 彬，等.泰山白花丹參提取物對H2O2誘導(dǎo)的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機制［J］.中國中藥雜志，2011，36(13):1830-1832.

［5］焦 鵬，常 起，陳 彬，等.泰山白花丹參提取物對人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、黏附及分泌NO的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(11):2687-2689.

［6］吳 雷，童志平，唐 康，等.動脈粥樣硬化的藥物治療的研究進(jìn)展［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2008，8(9):987-989.

［7］陳 鵬.動脈粥樣硬化藥物治療的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)信息，2011，24(8):5040-5041.

［8］彭琪琦，羅興林.氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化中的作用及研究現(xiàn)狀［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，33(6):710-712.

［9］周凱章，林輝麗.血紅素氧化酶-1對小鼠動脈粥樣硬化斑塊抑制作用的研究［J］.福建醫(yī)藥雜志，2008，30(1):89-90.

［10］秦 瑾，劉正湘.炎癥與動脈粥樣硬化［J］.實用心腦肺血管病雜志，2003，11(2):105-108.

［11］崔忠生，邸科前，馬煥云.哈巴苷及哈巴俄苷對腎上腺素?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.山東醫(yī)藥，2009，49(25):60-61.

［12］張 寧，尹美娜，李 聰，等.炎癥與動脈粥樣硬化［J］.臨床薈萃，2010，25(10):918-921.

［13］O’Neill T J，Wamhoff B R，Owens G K，et al.Mobilization of bone marrow-derived cells enhances the angiogenic response to hypoxia without transdifferentiation into endothelial cells［J］.Circ Res，2005，97(10):1027-1035.

［14］Zentilin L，Tafuro S，Zacchigna S，et al.Bone marrow mononuclear cells are recruited to the sites of VEGF－induced neovascularization but are not incorporated into the newly formed vessels［J］.Blood，2006，107(9):3546-3554.

［15］任振義，白春學(xué)，金一尊，等.多烯紫杉醇誘導(dǎo)SPC－A1肺癌細(xì)胞凋亡與活性氧之間的關(guān)系［J］.中國癌癥雜志，2003，13(4):342-344.

［16］叢也彤，亓 波，金龍哲，等.64排螺旋 CT檢測冠心病患者冠狀動脈斑塊分型的分布特點與其血清 IL-6、TNF-A含量的相關(guān)性［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29(19):2446-2448.