益氣化濁膠囊對KKAy小鼠骨骼肌組織中胰島素受體底物表達的影響

郭俊杰，張素超，趙玉立

(山西省中醫藥研究院，山西太原 030012)

胰島素抵抗(Insulin resistance)是2型糖尿病的病理生理基礎，貫穿2型糖尿病發展始終，在胰島素信號通路的各個環節均可發生。中醫藥在治療糖尿病有較好效果，在改善癥狀和防治并發癥上有一定的優勢，但缺乏對胰島素抵抗作用機理方面的深入研究。本實驗觀察益氣化濁膠囊對胰島素抵抗KKAy小鼠骨骼肌組織內胰島素受體底物IRS-1、IRS-2蛋白表達量的影響，進一步從蛋白水平探討其對糖尿病胰島素抵抗的作用機理。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 益氣化濁膠囊由黃芪、黃精、女貞子、蒼術、蠶繭、丹參、鬼箭羽組成，山西省中醫院制劑室生產，其中1/2量黃芪以藥材原藥入藥，兼作賦形劑，其余藥味采用水煎煮提取工藝，制成膠囊，批號20 100318;鹽酸吡咯列酮片由北京大洋藥業有限公司生產，批號100301。碘 ［125I］胰島素放射免疫分析藥盒購自北京普爾偉業生物科技有限公司，批號20100913。β-actin(Santa Cruz Biotechnology，1∶1000)，兔抗 IRS-1一抗(Bioworld公司，1∶1000)，兔抗 IRS-2一抗(cell Signling公司，1∶1000)，辣根酶標記的抗IgG抗體(北京康為世紀生物技術有限公司)。

1.2 實驗動物與分組 C57BL/6J小鼠與KKAy小鼠，8～10周齡，雌性，體質量25～28 g，購自中國醫學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK(京)2009-2004。C57BL/6J小鼠8只給予普通飼料，KKAy小鼠予高脂飼料(10%脂肪，10% 蔗糖，基礎飼料)，購自中國醫學科學院實驗動物中心。適應性喂養一周后，用微量血糖儀(美國強生公司穩豪?倍優型)連續兩次測KKAy小鼠血糖，以隨機血糖≥11.1 mmol/L診斷為糖尿病。將符合條件的KKAy小鼠隨機分為4組:模型對照組、陽性對照組(鹽酸吡格列酮)、益氣化濁膠囊高劑量組、低劑量組，每組8只。益氣化濁膠囊高劑量組予益氣化濁膠囊2 g/(kg·d)，臨床用量的20倍;低劑量組予益氣化濁膠囊1 g/(kg·d)，臨床用量的10倍;陽性對照組予鹽酸吡咯列酮2.5 mg/(kg·d)，臨床用量的10倍，正常對照組、模型對照組，以20 mL/(kg·d)給予等容積生理鹽水，灌胃給藥，一日1次，連續8周。灌胃前將益氣化濁膠囊用蒸餾水配置成質量濃度為0.1 g/mL、0.05 g/mL兩種溶液，將鹽酸吡格列酮研成細粉后用蒸餾水配置成質量濃度為0.13 mg/mL的溶液。(給藥量以60 kg/d的人用量計算。)

1.3 檢測指標

1.3.1 空腹血糖、血清胰島素及胰島素抵抗指數檢測 實驗動物禁食12 h后，采用微量血糖儀尾靜脈采血直接測空腹血糖，摘除眼球采血用放射免疫分析法測定空腹血清胰島素，計算穩態胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，其計算公式為=空腹血糖胰島素×空腹血糖/22.5［1］。

1.3.2 Western-blot檢測骨骼肌中IRS-1、IRS-2蛋白的表達 取100 mg骨骼肌組織，加入0.5 mL蛋白裂解液，超聲勻漿，離心，取上清，加入等體積的2×SDS buffer離心，收集上清，制備10%的分離膠及5%的濃縮膠，取存骨骼肌組織蛋白上清20μL，電泳約3 h，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后用去離子水沖洗，5%BSA溶液4℃封閉過夜，硝酸纖維素膜放入含有0.1%TBST沖洗2次，先后與一抗抗體、過氧化物酶標志的二抗及顯色底物孵育。用ECL底物化學發光顯色，顯影，定影，掃描。用photoshop軟件，計算亮度值，IRS-1、IRS-2蛋白表達水平以IRS-1/β-actin、IRS-2/β-actin 的比值表示。

1.4 統計學分析 實驗數據經SPSS 17.0統計軟件進行分析，以均數±標準差()表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 益氣化濁膠囊對KKAy小鼠血糖和胰島素水平的影響與正常對照組比較，模型對照組動物空腹血糖(FPG)、空腹血糖胰島素(FINS)、HOMA-IR顯著升高(P＜0.01);與模型對照組相比，陽性對照組、高劑量組FPG、FINS、HOMA-IR均顯著降低(P＜0.01或 P＜0.05)，低劑量組FPG降低(P＜0.05)(表1)。

表1 各組小鼠FPG、FINS、HOMA-IR水平比較

2.2 骨骼肌IRS-1蛋白的表達與正常對照組比較，模型對照組骨骼肌組織IRS-1蛋白表達量均顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性對照組IRS-1蛋白水平顯著升高(P＜0.01)，益氣化濁膠囊高、低劑量組IRS-1蛋白水平均升高(P＜0.05)。(表2，圖1)

2.3 骨骼肌IRS-2蛋白的表達與正常對照組比較，模型對照組骨骼肌組織IRS-2蛋白表達量均顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，陽性對照組IRS-2蛋白水平升高(P＜0.05)，益氣化濁膠囊高、低劑量組IRS-2蛋白水平均升高，但無統計意義。(表2，圖1)

圖1 IRS-1、IRS-2在骨骼肌組織中的表達

表2 骨骼肌組織中IRS-1、IRS-2蛋白表達水平

3 討論

2008年中華醫學會糖尿病學會組織的糖尿病流行病學調查結果顯示，在20歲以上的人群中，年齡標化的糖尿病患病率為9.7%，而糖尿病前期的比例更高達15.15%，成為世界糖尿病患病率增長最快國家之一［2］。研究表明［3］，92%的2型糖尿病患者存在胰島素抵抗，甚至在診斷2型糖尿病前15～20年已經存在胰島素抵抗。一項針對5728例受試者口服葡萄糖耐量試驗結果分析顯示，中國人群空腹血糖受損、葡萄糖耐量異常與胰島素抵抗與胰島素分泌功能的下降均有關［4］，不同糖耐量人群胰島素抵抗具有空腹血糖越高基礎胰島素抵抗越嚴重［5］。因此，改善胰島素抵抗已成為2型糖尿病臨床治療的首要問題。

本研究選用與人類的Ⅰ型糖尿病表現極為相似的KKAy小鼠模型作為研究對象，KKAy小鼠是在遺傳易感的的基礎上加環境因素而誘發，是一種理想的人類2型糖尿病動物模型［6］。正常對照組選擇與 KKAy小鼠具有基因同源性C57BL/6J小鼠［7］。實驗結果提示胰島素抵抗模型成立。

現代研究認為［8］PI3K/AKT途徑是胰島素信號傳導的經典途徑，IRS作為胰島素性信號轉導通路中的重要信號蛋白，既是胰島素受體酪氨酸激酶的底物，也是胰島素多種生物調節作用的中間體，在胰島素抵抗中起重要的作用［9］。IRS-1是最先發現的胰島素受體底物，其分布廣泛，主要在骨骼肌組織表達，骨骼肌是胰島素介導的葡萄糖攝取的關鍵靶器官之一，在餐后胰島素介導的80%的葡萄糖攝取有骨骼肌完成［10］。IRS-2與IRS-1相對分子質量相似，分布廣泛，但主要在肝臟和胰腺 β 細胞中表達［11］。Rui等［12］報道，延長胰島素的刺激作用能使IRS-1和IRS-2水平明顯下降。王冰等［13］報道胰島素抵抗大鼠肌肉組織中IRS-1 mRNA僅為正常組的47.9%。正常情況下，IRS-1在胰島素信號傳導中起主要作用，而當IRS-1受抑制時，IRS-2會成為胰島素受體的主要底物，但IRS-2需要更高濃度的胰島素才能產生作用［14］。當IRS-2表達減少時，會導致胰島素作用的減弱，減弱到一定程度時，胰島素信號的細胞內傳導即受到阻滯［15］。

臨床使用改善胰島素抵抗的藥物以噻唑烷二酮類為主，但此藥物對肝腎功能異常則禁用并存在水腫、心血管疾病的副作用。本實驗以吡格列酮為陽性對照藥，降糖機制是增加靶細胞對胰島素作用的敏感性。有實驗證明［16］吡格列酮的胰島素增敏作用可能與IRS-1、IRS-2蛋白的表達的增強有關。

2型糖尿病胰島素抵抗患者辨證多為氣陰兩虛，瘀濁互阻。中藥復方益氣化濁膠囊由黃芪、女貞子、蒼術、丹參、鬼箭羽、黃精、蠶繭組成，諸藥合用標本兼治，補瀉兼施，共奏益氣養陰補臟、祛瘀化濁通絡之功。本研究結果中，益氣化濁膠囊明顯降低KKAy小鼠FPG，降低HOMA–IR，改善胰島素抵抗;模型組骨骼肌組織中IRS-1、IRS-2蛋白表達水平顯著低于正常對照組，提示骨骼肌中IRS-1、IRS-2蛋白表達的減少可能是2型糖尿病胰島素抵抗的發病機制之一;陽性對照組骨骼肌組織中IRS-1、IRS-2蛋白表達水平顯著高于模型對照組，證實吡格列酮降血糖，改善胰島素抵抗，與增加骨骼肌中IRS-1、IRS-2蛋白表達有關;益氣化濁膠囊能增高IRS-1蛋白表達，與陽性對照組比較，IRS-2蛋白表達升高不明顯。

從實驗中推測出:益氣化濁膠囊作用機制可能與吡格列酮相似，通過上調骨骼肌中IRS-1蛋白表達，修復胰島素信號傳導通路，降低自發性2型糖尿病KKAy小鼠FPG、改善胰島素抵抗，IRS-2在骨骼肌發揮作用可能需要一定的條件，有待進一步實驗研究。

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