元素指紋圖譜在藿香正氣制劑質量評價中的應用

劉征輝，陳秋生，3，葉挺祥，趙洪芝，郭永澤，3，程 奕，3*

（1.天津海世達檢測技術有限公司，天津 300381；2.天津市現代中藥質量檢驗中心，天津 300381；3.天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381）

藿香正氣最早記載于北宋《太平惠民和劑局方》，距今已有千年歷史，最初藿香正氣只是散劑，隨著現代中藥制劑技術的進步，逐漸發展為多種劑型，藿香正氣水是其常用的一種，由蒼術、厚樸、白芷、甘草等十味中藥組成，具有解表化濕、理氣和中之功效，用于外感風寒、內傷濕滯或夏傷暑濕所致的感冒，癥見頭痛昏重、胸膈痞悶、脘腹脹痛、嘔吐泄瀉；胃腸型感冒見上述癥候者［1］。

電感耦合等離子體質譜技術是上個世紀80年代發展起來的無機元素和同位素分析測試技術，它以獨特的接口技術將電感耦合等離子體的高溫電離特性與質譜計的靈敏快速掃描的優點相結合而形成一種高靈敏度的分析技術。該技術具有精密度高；速度快，可在幾分鐘內完成幾十個元素的定量測定；譜線簡單，干擾相對于光譜技術要少；線性范圍可達7～9個數量級；樣品的制備和引入相對于其他質譜技術簡單；既可用于元素分析，還可進行同位素組成的快速測定［2-5］。本實驗采取微波消解進行樣品前處理，用ICP-MS同時測定藿香正氣制劑中的5種重金屬元素和9種其它微量元素量，采用化學計量學的手段對結果進行數據分析，旨在探索不同廠家生產的藿香正氣制劑無機元素分布的規律［6-14］，并從無機層面為中藥質量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 7500a電感耦合等離子體質譜儀 (ICP-MS):美國Agilent公司；MARS高通量密閉微波消解系統:美國CEM公司。玻璃器皿等用具經10%硝酸浸泡24 h后，用超純水洗凈。國家標準物質茶樹葉 (GBW08513):中國科學院生態環境研究中心；超純水由二次去離子水經Milli-Q裝置 (電阻率≥18 MΩ)處理而得。硝酸 (優級純，MOS級):天津市風船化學試劑科技有限公司。

多元素混合貯備液 (美國 Agilent公司，PN 5183-4688)。內標溶液:1.0 mg/L Y、Sc、In、Ge、Bi混合內標貯備液 (美國 Agilent公司，PN 5183-4680)。調諧液:10 μg/L U、Y、Ce、T1、Co(美國Agilent公司，PN 5184-3566)。藿香正氣樣品為市售，見表1。

表1 藿香正氣制劑樣品信息Tab.1 Information of Huoxiang Zhengqi Preparation samples

1.2 方法

1.2.1 混合標準溶液的配制 由多元素貯備液，用5%硝酸稀釋而成。系列標準溶液質量濃度為0、5、10、20、50 ng/mL。

1.2.2 樣品處理 針對液體制劑與固體制劑，分別采用了不同的前處理方法。

精密稱定藿香正氣水10 g于消解管中，置電熱板上加熱使其揮發乙醇，濃縮至3 mL左右，加硝酸5 mL，加蓋，預消解過夜。再置電熱板上120℃消解3h，待消解完全并冷卻后，趕酸至1.0 mL左右，使用超純水用重量法定質量至25 g。

精密稱定藿香正氣軟膠囊 (片、滴丸)約0.5 g于消解管中，加硝酸5 mL，加蓋，預消解過夜。再置電熱板上120℃消解6 h，待消解完全并冷卻后，110℃趕酸至1.0 mL，使用超純水用重量法定質量至25 g。

每個樣品平行2份，以計算測定結果的平均值和標準偏差。平行做11份空白。標準物質茶樹葉(GBW08513)，處理方法與樣品處理相同。

1.3 方法學考察

1.3.1 測定條件的優化 對RF功率、載氣流速、積分時間等參數進行優化，提高了離子化效率、降低了干擾。優化條件見表2。此外，通過在線加入內標元素，監測信號的變動情況，有效克服儀器信號的漂移，在選擇各個元素內標時，使用虛擬內標(VIS，Virtual Internal Standard)進行內標修正，可以提高定量的準確性。

表2 儀器工作參數Tab.2 Instrument parameters

1.3.2 線性范圍 在0～50 μg/L質量濃度范圍內，各元素的分析信號值與質量濃度均呈良好線性關系，見表3。

表3 各元素檢出限與回歸方程結果Tab.3 Results of LODs and regression equations

1.3.3 方法檢出限 用11份平行空白液的測定結果，以3倍標準偏差計算各元素的檢出限，見表3。

1.3.4 方法準確度 用標準物質茶樹葉(GBW08513)對分析方法的準確度進行驗證，測量值與標準值在允許誤差范圍內。

2 結果與分析

2.1 樣品測定 按實驗方法分別測定了27批次不同廠家的藿香正氣水 (軟膠囊、滴丸)各元素量，結果見表4、表5。

表4 不同藿香正氣產品中重金屬量Tab.4 Analysis results of heavy metal elements in different products of Huoxiang Zhengqi Preparations

2.2 藿香正氣元素指紋圖譜的化學模式識別研究 為了更加直觀的評價無機元素對藿香正氣制劑質量的影響，根據無機元素指紋圖譜5種重金屬元素和9種其它微量元素的量進行化學模式識別分析。

2.2.1 聚類分析 首先應用SPSS數據處理軟件對藿香正氣水進行聚類分析。利用歐氏距離(Euclidean)作為樣品的測度，采用離差平方和法(Ward's Method)進行聚類，得到聚類譜系圖。由聚類結果圖可以看出不同廠家之間的差異，但相同廠家的不同批次產品也存在差異。

圖1、圖2分別為5種重金屬元素和9種其它微量元素的聚類結果圖。兩類不用元素的聚類結果都將27個樣本分成了兩大類，1～18號為水劑歸為到類，其它固體制劑為另一類，但根據重金屬元素的聚類結果顯示26、27號滴丸制劑也被分在水劑這一類，提示滴丸制劑可能在工藝上與其它固體制劑的不同。

表5 不同藿香正氣產品中其它元素的量Tab.5 Analysis results of other elements in different products of Huoxiang Zhengqi Preparations

圖1 藿香正氣5種重金屬元素量分析聚類譜系圖Fig.1 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 5 heavy metal elements of Huoxiang Zhengqi Preparations

圖2 藿香正氣9種微量元素分析量聚類譜系圖Fig.2 Hierarchical cluster analysis dendrogram of 9 other elemtents of Huexiang Zhangqi preparations

2.2.2 主成分分析 通過對27批次的藿香正氣制劑元素指紋圖譜進行主成分分析，得到了5種重金屬元素的主成分得分圖 (見圖3)和9種其它微量元素的主成分得分圖 (見圖4)，明顯看出，其中1～18號距離相當緊密，明顯聚為一類，19～25號固體制劑分布在圖的上部分，26、27號滴丸樣品在液體制劑和其它固體制劑之間。這與聚類分析的結果相一致。

圖3 5種重金屬元素測定結果的主成分得分圖Fig.3 Principal component analysis(PCA)score figure of 5 heavy metal elements

圖4 9種微量元素測定結果的主成分得分圖Fig.4 Principal component analysis(PCA)score figure of 9 other elements

經計算得到主成分的模型為:

上式中，F1，F2分別表示兩個主成分，XCu，XAs，XCd，XHg，XPb分別表示各個元素的量數據。而兩個主成分中，F1是特征值最大的，即是“信息最多”的指標，而第一主成分中各個元素的系數基本相同，說明Cu、As、Cd、Hg、Pb各個元素的對分類的貢獻基本相同。

圖4為9種其它微量元素的主成分分析結果圖。按主成分個數提取原則為累計方差貢獻率大于85%的n個主成分，結果如下:第一主成分的特征值λ1=5.398，方差貢獻率為59.98%；第二主成分的特征值:λ2=1.381，方差貢獻率為15.343%；λ3=0.983，方差貢獻率為10.92%；3個主成分的累計方差貢獻率為86.24%，選取前3個得分矢量來作圖。圖中每個點對應1個樣本，從圖可知，此27個樣本可分為兩類，與聚類分析結果一致，即可印證聚類結果圖。

將每一個載荷量表示主成分與對應變量的相關系數除以主成分相對應的特征值開平方根便得到兩個主成分中每個指標所對應的系數，經計算可得主成分的模型為:

上式中，F1，F2，F3分別表示兩個主成分，XNa，XMg，XK，XCa，XMn，XFe，XNi，XZn，XSe分別表示各個元素的量經標準化后的數據。而兩個主成分中，F1是特征值最大的，即是“信息最多”的指標，而第一主成分中系數差別不大，XK，XCa的系數大于0.4，XFe的系數小于0.1，其它元素均差別不大，說明除Fe元素貢獻較小外，各個元素對分類的貢獻差別并不大。

3 討論

3.1 應用ICP-MS對不同產家不同劑型的藿香正氣產品進行了5種重金屬元素和9種其它微量元素的測定，并應用化學模式識別方法進行聚類分析和主成分分析，不同廠家的不同藿香正氣劑型均得到了很好的聚類結果，為建立基于無機元素分析的藿香正氣質量評價方法提供可能。

3.2 微量元素與活性分子在人體內起著相互協同、互相補充、互相滲透、互相制約的作用，并參與體內各種生化反應，促進機體自身調節，達到新的陰陽平衡，從而達到治療疾病的目的。本實驗還選取了9種其它元素進行測定，包括了人體必須的元素(Na、Mg、K、Ca)，微量元素 (Mn、Ni、Fe、Zn、Se)。從測定結果中發現滴丸中的 Cu、As、Cd、Hg、Pb元素的量普遍較低，與藿香正氣水中的量結果比較接近，導致滴丸劑型與水劑分類較為接近，但由于所收集滴丸樣本較少，此結論還待進一步研究確證。

3.3 通過上述研究發現，藿香正氣水不同廠家、不同劑型之間在化學物質層面存在著很大差異，我們在關注有機化合物對藥品質量影響的同時，應注意無機元素的量對藥效的影響，在藥品的質量控制中，探討有機物、無機物的雙層面控制保證藥品療效。因此，需要在現有的中藥質量控制模式上建立起較為全面的中藥質量控制與評價方法。

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