納米金催化光度法快速檢測葡萄糖

邱 小 香

(1.渭南師范學院化學與生命科學學院，陜西渭南714000;2.陜西省多河流濕地生態環境重點實驗室，陜西渭南714000)

0 引言

葡萄糖在醫學上常被稱為血糖，俗名又稱玉米葡糖、玉蜀黍糖、右旋糖和葡糖等，分子式為C6H12O6，白色晶體，易溶于水.其結構式中含5個羥基和一個醛基，具有多元醇和醛的性質［1］.葡萄糖在工業、食品、藥品上都有很多應用，所以對葡萄糖的定量分析有著很重要的意義.目前，用于檢測葡萄糖的方法主要有高效液相色譜法、滴定法、氣相色譜法、HPLC法［2］和生物傳感器法，其中液相色譜法雖然具有較好的靈敏度，但排除干擾能力差;滴定法雖然操作簡單，但是存在檢出限低、誤差大的問題;氣相色譜操作比較復雜;HPLC法和生物傳感器法的過程比較復雜，操作難度大.鑒于此，尋找一種快速、準確、簡單的葡萄糖檢測方法有著重要的意義.實驗采用納米金［3］催化葡萄糖與菲林試劑反應生成磚紅色的氧化亞銅微粒，基于紫外—可見分光光度法建立了利用其吸光度值與葡萄糖濃度之間的線性關系來測定葡萄糖含量的方法.實驗對反應溫度、反應時間、納米金的用量及菲林試劑(B)的用量等條件進行了優化.在最佳實驗條件下，葡萄糖濃度在0.05～1.00 mg/mL范圍內與吸光度值呈現良好的線性關系，線性回歸方程為△A870nm=1.3674c葡萄糖+1.0848，相關系數 R2=0.991.該方法具有成本低、操作簡單、靈敏度高等特點，并且用于注射劑中葡萄糖的檢測獲得了較好的結果.

1 實驗部分

1.1 主要儀器與設備

HH－2數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，UV－2000/2010紫外—可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)，電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司).

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑

葡萄糖(C6H12O6，天津登豐化學品有限公司)，酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6，天津致遠化學試劑有限公司)，硫酸銅(CuSO4·5H2O，天津恒興化學試劑制造有限公司)，抗壞血酸(C6H8O6，天津天泰精細化學品有限公司)，碳酸鉀(K2CO3，天津市化學試劑廠)，氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O，天津市光復精細化工研究所)，氫氧化鈉(NaOH，西安化學試劑廠)，葡萄糖注射液(上海華源安徽錦輝制藥有限公司).

實驗所用試劑均為分析純，所用的水都是二次蒸餾水.

1.2.2 納米金的制備

納米金的制備采用抗壞血酸還原法［5］.制備納米金所用的玻璃儀器在使用前用鉻酸洗液浸泡24 h，然后用二次水多次沖洗后烘干備用.取4℃冷卻的含1%氯金酸的溶液1.00 mL，現配的0.2 moL/L的碳酸鉀溶液1.50 mL及25 mL的水混合均勻，然后在其混合均勻后的溶液中邊攪拌邊加入含有0.7%的抗壞血酸溶液1.00 mL，溶液迅速變為紫紅色，緩慢加熱至溶液顏色變為亮紅色.該納米金的濃度為0.765 μg/mL.

1.2.3 菲林試劑的制備

菲林試劑(A):稱取3.75 g的CuSO4·5H2O，加水溶解至100 mL(以硫酸銅計為0.15 moL/L);菲林試劑(B):稱取酒石酸鉀鈉17.0 g溶解于20 mL的熱水中，加入20%的氫氧化鈉溶液20 mL，加水至100 mL(以酒石酸鉀鈉計為0.81 moL/L，含氫氧化鈉6.1 moL/L).

1.3 實驗原理及方法

1.3.1 實驗原理

本實驗基于葡萄糖的還原性，其與菲林試劑反應，生成氧化亞銅磚紅色的沉淀.納米金對這一反應有較強的催化作用［5－7］.氧化亞銅微粒在600～900 nm處有明顯的吸收，且隨著葡萄糖濃度的增加其吸光度值也隨之增大(見圖1c、d)，并在870 nm處呈良好的線性關系.根據葡萄糖濃度與吸光度值的線性關系及未知濃度葡萄糖溶液的吸光度值，計算出葡萄糖的濃度.

1.3.2 實驗方法

在10 mL的比色管中，依次加入0.40 mL 0.15 moL/L菲林試劑(A)溶液，2.0 mL 0.81 moL/L菲林試劑(B)溶液，200 μL 0.765 μg/mL的納米金，混合均勻后加入一定量的葡萄糖標準溶液，定容至10 mL.在70℃水浴中反應后流水快速冷卻至室溫，用分光光度計測得870 nm波長處的吸光度值，同時做空白試驗.

2 結果與討論

2.1 納米金對葡萄糖—銅(Ⅱ)微粒反應的催化作用和吸收光譜

實驗固定納米金的用量、菲林試劑(A、B)的用量、葡萄糖的濃度、反應溫度及反應時間，在600～900 nm的波長范圍內，分別對菲林試劑—納米金、菲林試劑—葡萄糖、菲林試劑—納米金－4.46 mg/mL葡萄糖及菲林試劑—納米金－5.08 mg/mL葡萄糖體系進行波譜掃描，結果如圖1所示.

從圖1可以看出，在實驗條件下，納米金對葡萄糖與菲林試劑的反應具有較強的催化作用(圖1b、d)，葡萄糖和菲林試劑反應生成的氧化亞銅微粒在可見光區600～900 nm之間均有吸收，且樣品與空白的吸光度值的差值在870 nm處較大，且具有良好的線性關系，故實驗選取870 nm為測定波長.

圖1 吸收光譜

2.2 反應條件的優化

2.2.1 菲林試劑(B)用量的優化

實驗固定納米金的用量、菲林試劑(A)的用量、葡萄糖的濃度、反應溫度、反應時間，改變菲林試劑(B)的用量.在10 mL的比色管中先加入0.40 mL 0.15 moL/L的菲林試劑(A)，然后分別加入0.50 mL、0.80 mL、1.00 mL、2.50 mL、3.50 mL 0.81 moL/L 的菲林試劑(B)溶液，再加入 0.35 mL 0.765 ug/mL 的納米金，混勻后加入0.20 mL 10.11 mg/mL的C6H12O6，70℃水浴加熱4 min，流水冷卻后測其870 nm處的△A值.根據菲林試劑(B)的用量和吸光度值的關系作圖，結果如圖2所示.

圖2 菲林試劑(B)用量的影響

由圖2可以看出，在其他條件不變的情況下，當菲林試劑(B)的用量在0.80 mL時△A的值最大.為了取得較大的吸光度值使實驗具有更好的靈敏度及節約試劑，實驗選用菲林試劑(B)的用量為0.80 mL.

2.2.2 反應時間的優化

固定葡萄糖的濃度(0.4044 mg/mL)、菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、納米金的加入量(0.35 mL)及反應溫度(70℃);控制反應時間分別為 1 min、3 min、5 min、7 min、9 min，流水冷卻后測定870 nm處△A值.由吸光度值與時間作圖結果為圖3.

圖3 反應時間的影響

由圖3可以看出，在其他條件不變時，反應時間在1 min以內，反應幾乎不發生;在1～3.5 min內吸光度值快速升高;3.5～4.5 min之間吸光度值有所下降;5 min以后吸光度值幾乎不變.為了獲得較大的吸光度值從而提高實驗的靈敏度，同時減少因操作導致的反應時間上的差異對實驗結果的影響，選擇5 min作為最佳實驗條件.

2.2.3 納米金用量的優化

控制葡萄糖的濃度(0.4044 mg/mL)、菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、反應時間(5 min)及反應溫度(70℃)不變，分別加入納米金0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.50 mL，流水冷卻后測得870 nm處的△A值.作圖結果如圖4.

圖4 納米金用量的影響

由圖4可以看出，當加入納米金的量在0.10～0.20 mL時吸光度值變化不大;納米金的用量在0.20～0.50 mL之間隨著納米金的用量的變化△A的值先增大后減小，且用量在0.35 mL時△A的值最大.故實驗中納米金的用量應選取0.35 mL.

2.2.4 反應溫度的優化

按照實驗方法，在固定葡萄糖的濃度(0.4044 mg/mL)、菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:2.00 mL)、納米金的加入量(0.35 mL)，分別在50℃、60℃、70℃、80℃水浴中反應3 min，測得吸光度值與溫度之間的線性關系如圖5所示.

圖5表明，在常溫下葡萄糖和菲林試劑幾乎不發生反應;而溫度從50℃ ～70℃變化時，吸光度值迅速增大，說明當溫度在50℃ ～70℃之間時該反應在納米金的催化作用下反應速率快速增大;當溫度大于70℃后，反應速率雖然有所增加但增加的速度相對緩慢，說明此時納米金的催化作用降低，而導致反應速率增大的原因主要是非催化作用，即溫度對反應速率的影響.但溫度過高也加快了氧化亞銅微粒之間的碰撞，從而導致大量的氧化亞銅微粒發生聚集而快速沉淀，導致△A870nm迅速降低［8］.為了取得較大的△A870nm值，減少產物體系的穩定性對實驗結果的影響，實驗選擇70℃為最佳反應溫度.

圖5 反應溫度的影響

2.3 標準曲線的繪制

按照實驗方法，在最優實驗條件下，保持菲林試劑的用量(A:0.40 mL，B:0.80 mL)、納米金的用量200 μL，混勻后分別加入濃度為 10.11 mg/mL 的葡萄糖標準溶液 0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.90 mL，在最佳的反應溫度(70℃)下，反應5 min后流水冷卻至室溫，應用上述建立的紫外—可見分光光度法測定其吸光度值.根據吸光度值和葡萄糖濃度的關系作圖，結果如圖6所示.由圖6可以看出，葡萄糖濃度在0.05～1 mg/mL范圍內與△A值呈現較好的線性關系，線性回歸方程為△A870nm=1.3674C葡萄糖+1.0848，相關系數 R2=0.991.

圖6 葡萄糖的濃度和吸光度值的線性圖

2.4 樣品測定

準確移取1.00 mL葡萄糖注射液，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度.在10 mL的比色管中加入菲林試劑(A)0.40 mL，菲林試劑(B)0.80 mL，納米金200 uL，混勻后加入上述溶液1.00 mL，70℃水浴反應5 min，流水冷卻后測其吸光度值.根據標準曲線得出溶液濃度.

2.5 加標回收試驗

每組準確加入葡萄糖注射液的稀釋溶液1.00 mL，分別加入濃度為10.11 mg/mL的葡萄糖標準溶液0.23 mL、0.41 mL、0.51 mL.在70℃水浴下反應5 min，流水冷卻后測得吸光度值.計算回收率結果如表 1所示.結果表明，回收率為102.64% ～107.57%，說明該方法的準確度高.

表1 回收率試驗結果

3 結語

實驗結合納米金對葡萄糖還原銅(Ⅱ)的反應具有較強催化作用、氧化亞銅微粒在870 nm處的特定吸收，建立了納米金催化光度法測定葡萄糖的新方法.與其他方法比較，該方法所用試劑廉價、操作簡單，用于葡萄糖注射液的測定，結果滿意.

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