紫草素對淋巴瘤治療作用研究

翟月

四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院，四川 成都 610041

B細胞非霍奇金氏淋巴瘤是一種發(fā)病率較高，但目前治療效果不理想的腫瘤疾病[1]。紫草素作為紫草有效成分之一，在抗炎、抗微生物及抗腫瘤等作用受到人們關注。其中，紫草素作為抗腫瘤藥物，效能高，腫瘤耐藥性低[2]。Rajasekar S等人報道紫草素具有抗皮膚癌作用[3]。同時，紫草素可以抑制人類結直腸癌細胞在體內(nèi)外的生長[4]。另外，紫草素可以通過活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）誘導肝癌細胞凋亡[5]。除了可以直接引起腫瘤細胞免疫原性的死亡，紫草素也能夠增強基于樹突細胞腫瘤疫苗的作用[6]，或是通過誘導活化正常T細胞表達和分泌的調(diào)節(jié)因子（Regulated on Activation,Normal T cell Expressed and Secreted,RANTES），增強基于基因表達的腫瘤疫苗[7]。然而，紫草素在B細胞非霍奇金淋巴瘤的治療作用并不明確。本實驗以人Raji細胞，即B細胞非霍奇金淋巴瘤細胞作為對象，研究紫草素誘導Raji細胞死亡能力，進一步了解紫草素對B細胞非霍奇金淋巴瘤的抑制作用。

1.方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人Burkitt’s 淋巴瘤 Raji細胞系購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection,ATCC）。Raji細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)，每2d換一次液。

1.2 PI染色檢測細胞死亡

105個/mL細胞1mL接種于12孔板，分別做對照組（CTL），紫草素組(SHK)，。對照組加入1.0μLDMSO，SHK組加入10μmolL-1紫草素，孵育6h。處理完成的細胞1 000 r/min離心5 min，棄去上清。用4 ℃ 預冷的PBS洗3 次，1 000 r/min 離心5min，去上清，用100 μL結合緩沖液重新懸浮細胞，加入5μL 的碘化丙啶(PI)溶液;混勻后于室溫避光孵育15 min;在反應管中加入400 μL PBS，流式細胞儀分析。

1.3 中性紅檢測細胞存活率

中性紅可以被活細胞攝入后累積在溶酶體中，活細胞增多時攝入的中性紅量增加，而細胞活性下降或細胞數(shù)減少時攝入的中性紅會減少。因此，通過將5*105個/mL細胞1mL接種于12孔板，分別加入不同濃度的紫草素（0μmol·L-1，1.25μmol·L-1，2.5μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1及80μmol·L-1），孵育6h。紫草素誘導后，先用無菌PBS適當溶液洗滌2次，隨后600μl細胞培養(yǎng)液重懸細胞，每孔加入60μl中性紅染色液,細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時。2小時后去除含有中性紅染色液的細胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌1-2次。加入200微升中性紅檢測裂解液，室溫搖床上裂解10分鐘。全波長酶標儀測定樣品的A540，690nm作為參考波長[8]。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS進行統(tǒng)計學分析，借助GraphPad Prism5軟件進行作圖。以上實驗均重復三次，實驗結果以 ±SD表示.其中統(tǒng)計檢驗以不同實驗組與最對照組分別比較，采用t檢驗。p<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。

2.結果分析

2.1 紫草素誘導Raji細胞死亡

PI單染熒光顯微鏡分析結果如圖1所示，右圖加入紫草素的實驗組中PI單陽細胞，即死亡細胞數(shù)目明顯多于左圖實驗組。由此可得出紫草素能夠誘導Raji細胞發(fā)生死亡。

圖1：紫草素對Raji細胞死亡的影響熒光顯微鏡下Raji細胞死亡情況，左圖為對照組，右圖為實驗組。

2.2 紫草素誘導Raji細胞死亡呈濃度依賴

紫草素對Raji細胞的生長抑制作用如圖3所示。中性紅細胞存活率檢測（圖2）可知，隨著藥物濃度增大（0μmol·L-1，1.25μmol·L-1，2.5μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，20μmol·L-1，40μmol·L-1及80μmol·L-1），紫草素對Raji細胞生長抑制作用逐漸增強。以上實驗證明紫草素可誘導Raji細胞死亡，并呈濃度依賴。

圖2 不同濃度紫草素對Raji細胞的生長抑制作用

中性紅染色檢測不同濃度紫草素對細胞生長抑制作用。*表示p<0.05，**表示p<0.01。

3.討論

紫草素作為一種植物提取物，具有多種生物學功能，尤其是其腫瘤抑制作用受到廣泛認可。紫草素抗腫瘤作用與其誘導細胞死亡的能力有關。本實驗表明，紫草素可以抑制Raji細胞生長增殖，誘導Raji細胞死亡，并呈濃度依賴。這提示紫草素在非霍奇金B(yǎng)細胞淋巴瘤的治療中有重要作用。但紫草素治療腫瘤的機制，尤其是其誘導死亡的類型還有待進一步研究。盡管紫草素對于許多疾病來說是一種治療作用顯著的藥物，但其毒性不可忽視，合理規(guī)范的使用紫草素十分重要。

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