自噬溶酶體抑制劑氯化銨促進維生素K3誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用*

于春艷， 劉 希， 張 鈺， 蘇 靜， 劉玉和△

維生素K3(vitamin K3，VK3)可以通過誘導細胞氧化應激而誘導腫瘤細胞損傷和細胞死亡［1］。我們的研究也發現維生素K3能誘導HeLa細胞發生自噬［2］。有實驗發現氧化應激誘導的自噬具有維持細胞穩態的功能［3］;而另外的實驗結果卻顯示自噬是II型程序化細胞死亡的形式［4］?？梢娂毎允傻淖饔脧碗s，VK3誘導的細胞自噬在腫瘤治療中的作用及其機制還需要進一步探討。因此本實驗以He-La細胞為研究對象，應用溶酶體抑制劑氯化銨(ammonium chloride，NH4Cl)［5］觀察對 VK3 處理 HeLa 細胞的溶酶體通透性、對自噬泡形成的影響，同時觀察對細胞漿pH值的影響及對VK3作用后HeLa細胞凋亡的影響，探討VK3誘導的細胞自噬在氧化應激誘導HeLa細胞凋亡過程中的作用。

材料和方法

1 材料

人HeLa細胞購自中國科學院和北京協和醫院;新生小牛血清購自 Gibco，IMDM培養基購自 Hy-Clone;MTT 粉末、吖啶橙(acridine orange，AO)、BCECF-AM和Hoechst 33342均購自Sigma;單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)購自 Invitrogen。其它試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 細胞培養 HeLa細胞置于完全培養基 (10%新生牛血清，IMDM 培養液，pH 7.4)中，37℃、5%CO2培養箱中培養。實驗分組:對照(control)組(細胞用 IMDM 培養);VK3(30 μmol/L)組;NH4Cl(10 mmol/L)組;VK3(30 μmol/L)+NH4Cl(10 mmol/L)組。

2.2 MTT法檢測細胞存活率 各組細胞以1×104cells/well接種至96孔板，每孔100 μL，每組細胞6復孔，于培養結束前4 h，加入5 g/L的MTT 20 μL。培養結束后，傾去培養基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，使結晶完全溶解，用酶聯免疫檢測儀于570 nm波長處測定其吸光度(absorbance，A)，可間接反映活細胞數量，用以檢測細胞活性。對照組細胞生存率為100%，其余各組生存率(%)=(各濃度組A值/對照組A值)×100%。

2.3 AO染色檢測溶酶體穩定性 將AO加入各組細胞中，終濃度為1 μmol/L，37 ℃孵育15 min，棄去染料，用PBS洗滌3次，405 nm 激發下［6］，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

2.4 MDC染色檢測自噬泡的形成 將各組細胞爬片用含PBS的0.05 mmol/L MDC在37℃孵育60 min，孵育后的細胞用PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫下固定10 min，用激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。以細胞內出現點狀染色為陽性表現［7］。

2.5 BCECF-AM檢測細胞漿pH值 取對數生長期的細胞藥物處理后，胰酶消化，分別收集各組的細胞樣品，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無血清無酚紅培養基洗1次。使用pH敏感的探針BCECFAM(20 μmol/L)標記細胞，37℃下孵育細胞20 min，FACScan 488 nm激發，相應的胞內pH值根據其熒光強度大小顯示于二維點陣圖上(X軸520 nm，Y軸640 nm)，記錄520/640發射熒光，求出該比值，該比值代表堿/酸pH值的比值，此比值低，代表pH值是酸性的。R2區域代表含有酸性pH值的細胞數［8］。

2.6 Hoechst 33342染色檢測凋亡細胞核形態 將10 mg/L Hoechst 33342加入各組細胞中，37℃孵育10 min，4% 多聚甲醛固定5～10 min后，棄去上清，用PBS洗滌，353～365 nm激發下顯示藍色熒光，激光共聚焦顯微鏡下觀察，計數凋亡細胞數并計算凋亡率。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0統計學軟件分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 NH4Cl和VK3對HeLa細胞存活率的影響

MTT結果顯示，單獨應用NH4Cl對HeLa細胞存活率沒有影響 ［(96.6±4.3)%］。VK3組細胞生存率為(77.1±3.3)%，VK3與氯化銨共同作用組He-La細胞存活率為(53.5±4.1)%，低于VK3作用組，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2 AO染色檢測溶酶體通透性

AO染色共聚焦顯微鏡觀察顯示，在VK3聯合NH4Cl處理的HeLa細胞中紅色熒光減弱，綠色熒光增強，而單獨應用VK3或NH4Cl處理細胞AO染色沒有改變，見圖1。

3 MDC檢測自噬泡的變化

MDC染色激光共聚顯微鏡觀察顯示，與對照組相比，在單獨應用VK3作用12 h后細胞內綠色點狀熒光亮度明顯增強，提示VK3組細胞自吞噬泡產生明顯增多。聯合應用 VK3和NH4Cl與單獨應用VK3相比，細胞內綠色點狀熒光亮度增強更明顯，提示自噬泡的數量顯著增加，見圖2。

Figure 1.Lysosomal permeabilization analysis for acridine orange staining in HeLa cells(×400).圖1 AO染色激光共聚焦檢測HeLa細胞溶酶體通透性的變化

Figure 2.Fluorescence microscopic analysis for MDC staining in HeLa cells(×400).圖2 MDC染色檢測HeLa細胞自噬泡的變化

4 BCECF-AM檢測細胞漿酸化程度

單獨應用VK3作用HeLa細胞，FL1/FL2比值降低(P ＜0.05)。聯合應用 VK3和 NH4Cl，FL1/FL2比值與單獨應用VK3相比明顯降低(P＜0.05)，見圖3。R2區域代表含有酸性pH的細胞。單獨應用VK3，酸性pH的細胞比例為13.6%，聯合應用VK3和NH4Cl，酸性pH的細胞比例為43.8%，提示細胞漿呈酸性，見圖4。

5 Hoechst 33342檢測NH4Cl和VK3對HeLa細胞凋亡的影響

經Hoechst 33342染色之后，與單獨應用VK3［凋亡率(10.6±3.3)%］相比，聯合應用 VK3和NH4Cl細胞核呈現固縮濃染，核分葉狀或月牙狀，呈典型凋亡細胞的形態，凋亡率為(28.6±3.7)%，見圖5。

討 論

Figure 3.Changes of cytosolic pH induced by NH4Cl in HeLa cellsloaded with pH-sensitive fluorescentprobe BCECF-AM.Mean± SD.n=3.*P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs VK3 group.圖3 BCECF-AM檢測HeLa細胞胞漿酸化程度的變化

已有報道，許多抗腫瘤藥物在發揮抗腫瘤作用時產生了氧化應激，而且ROS產生是藥物發揮細胞毒性作用的必要因素［9］。某些化療藥物，例如三氧化二砷、evodiamine誘導 U251或 HeLa細胞產生ROS聚積，直接作用于線粒體，導致細胞凋亡［10］。研究發現，ROS 能誘導細胞自噬［4］。Zhang等［11］報道H2O2能夠引起U251細胞LC3-II蛋白水平增加及自噬泡增多，用自噬早期階段特異性抑制劑3-MA抑制自噬，降低了H2O2引起的細胞凋亡。溶酶體抑制劑氯化銨能夠增加蛇毒素Crotoxin對K562細胞的細胞毒性，細胞對蛇毒素更加敏感［12］，MTT實驗的結果表明，使用氯化銨后能夠使VK3誘導的細胞存活率進一步降低，提示VK3誘導HeLa細胞發生的自噬可能減輕維生素K3誘導的氧化應激損傷。

Figure 4.The proportion of cells with acidic intracellular pH detected by BCECF-AM.圖4 BCECF-AM檢測細胞漿內酸性的細胞比例

Figure 5.Fluorescence microscopic analysis for Hoechst 33342 staining in HeLa cells treated with NH4Cl and VK3(×400).圖5 Hoechst 33342檢測NH4Cl和VK3對HeLa細胞凋亡的影響

自噬是溶酶體依賴的降解途徑，是一個動態過程，其中最后一個過程是自噬體與溶酶體融合，最終降解細胞漿物質和細胞器［13］。Kawai等［14］用 bafilomycin A1、氯喹及氯化銨分別處理饑餓條件下的CHO細胞，發現線粒體與溶酶體沒有發生共定位，結果證明溶酶體的酸性對自噬體與溶酶體融合非常必要。研究發現，自噬能清除神經退行性疾病神經元細胞中的蛋白聚集物及衰老的細胞中受損傷的線粒體等細胞器。饑餓［15］引起HeLa細胞發生自噬或者堿性藥物temozolomide［16-17］引起膠質瘤細胞發生自噬時，用bafilomycin A1或羥氯喹處理后，發現自噬體與溶酶體融合被抑制，caspase激活、線粒體膜通透性增加，自噬體內容物長壽命蛋白的降解也減少。在順鉑耐受的人卵巢癌細胞及HeLa細胞中，順鉑激活的自噬能有效地運輸錯誤折疊蛋白，使腫瘤細胞避免細胞凋亡［18-19］。有研究發現，如果不能清除細胞內堆積的蛋白質，這些蛋白將對細胞具有毒性，可能引起凋亡［20］。AO實驗及MDC實驗的結果表明，聯合應用VK3和NH4Cl后，HeLa細胞溶酶體膜通透性增高，細胞內自噬泡大量堆積，凋亡細胞數也增多，提示NH4Cl由于增加了溶酶體通透性，阻止自噬體與溶酶體融合，促使細胞內堆積了大量自噬泡。自噬的完整過程被破壞，不能維持細胞穩態，從而促進細胞發生凋亡。

TNF-α作用U937細胞時，溶酶體組織蛋白酶D從細胞內轉位至細胞漿，應用溶酶體去垢劑MSDH作用于U937細胞，也發現溶酶體組織蛋白酶D從細胞內轉位至細胞漿，同時細胞漿酸化［21］。H2O2［22］或抗腫瘤藥物［23］作用白血病細胞HL60，引起細胞漿酸化，進而促凋亡蛋白Bax轉位至線粒體，caspase-3被激活，細胞色素C從線粒體釋放入細胞漿，發生細胞凋亡。BCECF-AM實驗及Hoechst 33342實驗的結果表明，聯合應用VK3和NH4Cl，FL1/FL2比值與單獨應用VK3相比明顯降低，酸性細胞數比單獨應用VK3增多，細胞漿發生酸化，從而促進細胞凋亡。

總之，我們的研究證明了自噬溶酶體抑制劑氯化銨干擾細胞自噬完整過程，促使對VK3誘導的HeLa細胞凋亡增多。自噬在氧化應激誘導的凋亡中發揮了保護作用，有利于腫瘤細胞生存。聯合抑制自噬作用將有利于氧化應激抗腫瘤治療效果。

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