骨髓間充質干細胞通過上調EPO表達減輕缺氧損傷引起的PC12細胞凋亡*

莫世靜， 童秀珍， 鐘 茜， 鄧宇斌，4△

(1中山大學中山醫學院病理生理學教研室，廣東廣州510089;2中山大學附屬第一醫院血液科，廣東廣州510080;3中山大學腫瘤防治中心實驗研究部，廣東廣州510060;4中山大學附屬第一醫院轉化醫學中心實驗室，廣東廣州510080)

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)是一類存在于骨髓間質內的非造血干細胞，近年來已被廣泛應用于缺血性腦卒中、脊髓損傷和缺血缺氧性神經細胞的治療及修復。大量研究表明，移植的BM-MSCs能遷移至損傷局部微環境并分化為神經元樣細胞或通過分泌各種營養因子等改善神經功能從而促進損傷修復［1-2］。然而，BM-MSCs究竟通過何種機制促進神經功能修復這一問題尚有爭議，明確BM-MSCs的細胞保護作用機制能更加有利于BM-MSCs的移植治療研究。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是由腎小管細胞合成分泌的細胞因子超家族成員。EPO及其受體EPOR在紅細胞、肝臟、腎臟和神經元等多種組織中廣泛表達。本實驗在前期研究的基礎上，為了更好地闡明移植BM-MSCs對神經細胞的保護作用及機制，為BM-MSCs的進一步應用提供實驗依據，應用體外氯化鈷(CoCl2)缺氧損傷的細胞共培養模型，RT-PCR檢測PC12細胞的Bcl-2和Bax表達，流式細胞術檢測PC12細胞凋亡，Western blotting檢測BM-MSCs的EPO表達，探討BM-MSCs對CoCl2誘導的神經元樣PC12細胞凋亡的保護作用及其可能機制。

材料和方法

1 材料和主要試劑

SPF級SD大鼠，80 g，購自中山大學實驗動物中心，DMEM/F12和DMEM高糖培養基購自Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco，羊抗大鼠抗EPO購自R﹠D System。Hoechst 33258購于Sigma。PC12細胞購自美國模式培養物保藏所(A-merican Type Culture Collection，ATCC)，Control siRNA及EPO siRNA購自Santa Cruz。

2 主要方法

2.1 大鼠BM-MSCs的分離和培養 大鼠斷頸處死，75%乙醇浸泡5 min，無菌條件下取雙側股骨，徹底清除附著其上的肌肉組織，剪斷干骺端暴露骨髓腔，DMEM/F12培養液反復沖洗骨髓腔至骨髓腔變白，制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加人含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸細胞種植于25 cm2培養瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養，3 d后更換培養液，去除未貼壁細胞，以后每3 d換液1次，按1∶2傳代，取第5代BM-MSCs備用。

2.2 PC12細胞培養及分組 PC12細胞置于含10%的胎牛血清的DMEM高糖培養液中，37℃、5%CO2的飽和濕度下培養，細胞匯集至80%時進行傳代接種后，將培養的細胞分別加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L CoCl2處理24 h或48 h，同時采用1∶50、1∶20、1∶15、1∶10 和 1∶5 細胞比的 BM-MSCs 與PC12細胞共培養。此外，將PC12細胞分為以下幾組:BM-MSCs-siCTL共培養+CoCl2處理24 h組和BM-MSCs-siEPO共培養 +CoCl2處理24 h組，每組各設空白對照組和CoCl2單獨處理24 h組。

2.3 MTT檢測 將PC12細胞以4×104接種于96孔板，50 μL/well。在37 ℃、5%CO2條件下常規培養過夜后，按實驗要求給予不同處理，處理完畢后，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續培養 4 h，吸出培養液，加150 μL DMSO，待其完全溶解后，用酶聯免疫儀在波長490 nm處讀取吸光度(A)。存活率(%)=(實驗孔A值/對照孔A值)×100%。

2.4 Western blotting檢測EPO蛋白表達 BM-MSCs接種于6孔板，給予0.6 mmol/L CoCl2分別處理24和48 h，處理完畢后，加入細胞裂解液，4℃裂解30 min，取蛋白液，采用BCA法進行蛋白定量。總蛋白經SDS-PAGE分離后，轉移到NC膜上。用5%BSA封閉1 h，隨后加入羊抗大鼠EPO抗體(1∶1 000)，4℃過夜，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法顯色，用凝膠成像系統掃描分析結果。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集處理后的PC12細胞至2 mL的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。用PBS緩沖溶液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，用 loading buffer重懸細胞，加入Annexin V反應液室溫下避光孵育10～15 min。流式細胞術(flow cytometry，FCM)分析凋亡情況。結果判斷:在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為FITC－/PI－;右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為FITC+/PI+;而右下象限為凋亡細胞，顯現 FITC+/PI－。

2.6 Hoechst 33258染色 將 PC12細胞 (4×104cells/well)接種于6孔板，4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS洗3次，5 mg/L Hoechst 33258染色液染色15 min，室溫下PBS洗3次，熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。細胞核出現彌漫均勻的低強度熒光記為正常細胞;細胞核呈濃染致密的固縮形態或者顆粒狀熒光記為凋亡細胞。

2.7 RT-PCR檢測 分別于處理前和處理后24 h用RT-PCR法檢測。用0.6 mmol/L CoCl2及1∶15細胞比的BM-MSCs-siCTL或BM-MSCs-siEPO共培養處理PC12細胞，提取 PC12細胞總 RNA，測 A值計算RNA的純度。逆轉錄后，取cDNA做PCR，引物設計如下:β-actin上游引物5'-GAACCCTAAGGCCAAC-3'，下游引物 5'-TGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增片段305 bp。EPO上游引物5'-ATTTGCGACAGTCGCGTTCT-3'，下 游 引 物 5'-GTATCCGCTTGAAGTGTTCG-3'，擴增片段307 bp。Bcl-2上游引物5'-CGACTTTGCAGAGATGTCCA-3'，下游引物 5'-ATGCCGGTTCAGGTACTCAG-3'，擴增片段224 bp。Bax上游引物5'-AGACAGGGGCCTTTTTGTTAC-3'，下游引物 5'-GAGGACTCCAGCCACAAAGAT-3'，擴 增 片 段 482 bp。PCR反應條件為預變性94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 10 min。以 β-actin為內參照，30個循環，EPO、Bcl-2和Bax擴35個循環。產物瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像儀及Bio-ID軟件進行圖像和條帶灰度值分析。

2.8 分光光度法檢測caspase-9和-3活性 按不同條件處理PC12細胞，用胰酶消化，并收集至備用的細胞培養液中。600 r/min 4℃離心5 min收集細胞，小心吸除上清，同時確保盡量沒有細胞被吸除，PBS洗滌1次。同前吸盡上清后，加入100 μL裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。加入Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)后混勻，注意避免在混勻時產生氣泡。37℃孵育60～120 min。發現顏色變化比較明顯時可測定吸光度值。

3 統計學處理

數據采用SPSS 11.0統計軟件進行分析。數據以均數 ±標準差(mean±SD)表示。組間比較行方差分析(ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 BM-MSCs共培養對CoCl2引起的PC12細胞活性下降的影響

0.1 、0.2、0.4、0.6 和 0.8 mmol/L CoCl2處理PC12細胞24 h和48 h，細胞活性分別為 (93.8±3.4)%、(91.7±3.1)%、(83.8±2.5)%，(44.0±7.5)%、(32.2±5.9)%和(90.0±4.0)%、(84.3±1.6)%、(68.7±2.9)%、(32.7±1.9)%、(25.4±0.9)%，見圖1A。同時，0.6 mmol/L CoCl2處理24 h和48 h后，PC12細胞活性下降為 (43.0±6.4)%和(33.8±5.7)%，而BM-MSCs共培養使細胞活性分別上升至 (49.4±6.8)%、(63.5±6.2)%、(77.9±3.8)%、(69.2±4.1)%、(67.1±6.0)%和(43.5±1.4)%、(61.3±4.3)%、(75.2±9.7)%、(65.7±10.7)%、(64.7±10.2)%，其中1∶15細胞比的效果最明顯，見圖1B。上述結果表明:0.6 mmol/L CoCl2處理24 h和48 h明顯降低PC12細胞活性(P＜0.01)，而BM-MSCs共培養可明顯抑制CoCl2引起的PC12細胞活性下降，差異有統計學意義(P＜0.01)。

2 EPO siRNA對BM-MSCs EPO表達的影響

如圖2所示，BM-MSCs經0.6 mmol/L CoCl2刺激24 h后，EPO mRNA與蛋白表達水平明顯上升，于48 h到達最高，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。而EPO siRNA轉染可明顯抑制CoCl2引起的BM-MSCs EPO mRNA與蛋白表達(P＜0.01)。

Figure 1.Effect of BM-MSCs on decreased viability of PC12 cells induced by CoCl2.A:PC12 cells were treated with CoCl2(0.1，0.2，0.4，0.6 and 0.8 mmol/L)for 6，12，24 and 48 h，and cell viability was assessed using MTT assay;B:the viability of PC12 cells co-cultured with BM-MSCs(BM-MSCs:PC12 cells=1∶50，1∶20，1∶15，1∶10 and 1∶5)and treated with CoCl2(0.6 mmol/L)was assessed 24 and 48 h later.Mean ± SD.n=3.*P ＜0.05 vs 0 mmol/L;##P ＜0.01 vs control;△△P ＜0.01 vs CoCl2.圖1 BM-MSCs對CoCl2誘導的PC12細胞活性下降的影響

Figure 2.Effect of EPO siRNA on mRNA(A)and protein(B)expression of EPO in BM-MSCs treated with 0.6 mmol/L CoCl2for 24 and 48 h.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control(without treatment);##P ＜0.01 vs CoCl2at the same time point.圖2EPO siRNA對BM-MSCs EPO表達的影響

3 EPO siRNA對BM-MSCs介導的PC12細胞保護作用的影響

Annexin V/PI雙染色法顯示24 h對照組PC12細胞早期凋亡率和晚期凋亡率分為(1.2±0.5)%和(2.2±0.4)%;0.6 mmol/L CoCl2處理PC12細胞24 h，凋亡率增加到(26.7±4.5)%和(34.6±5.7)%(P＜0.01)。BM-MSCs-siCTL共培養可以減少CoCl2引起的細胞凋亡，使細胞凋亡率降低至(6.1±0.8)%和(14.5±1.1)%，而EPO siRNA可明顯抑制BM-MSCs引起的細胞凋亡下降作用，細胞凋亡率由(18.8±1.8)%和(32.4±3.3)%僅降低至(13.3±1.5)%和(25.9±4.9)%(P＜0.01)，見圖3。Hoechst 33258熒光染色顯示正常組PC12細胞染色質分布均勻，為彌漫均勻的低強度熒光;CoCl2處理組細胞核呈濃縮致密的固縮形態或顆粒狀熒光;BMMSCs-siCTL共培養組凋亡細胞較陽性對照組明顯減少，而BM-MSCs-siEPO共培養組細胞核呈濃縮致密的固縮形態或顆粒狀熒光的細胞明顯增多(P＜0.01)，見圖4。上述結果提示:BM-MSCs能有效抑制CoCl2的致細胞凋亡作用，BM-MSCs的抗凋亡作用可能與其上調EPO的表達有關。

4 Bcl-2和Bax的表達

PC12細胞經0.6 mmol/L CoCl2處理24 h，可觀察到Bcl-2的表達下降和Bax的表達上升，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。BM-MSCs共培養可以有效抑制CoCl2引起的Bcl-2表達下降和Bax表達上升(P＜0.01)。BM-MSCs對PC12細胞基礎的Bcl-2和Bax表達無明顯影響(P＞0.05)。EPO siRNA的應用則可以明顯阻斷BM-MSCs的作用(P＜0.01)，見圖5。上述結果提示:BM-MSCs介導的細胞保護作用可能與其上調PC12細胞的Bcl-2表達和下調Bax表達有關。

Figure 3.Effect of EPO siRNA on the apoptosis of PC12 cells co-cultured with BM-MSCs detected by flow cytometry.PC12 cells were co-cultured with BM-MSCs-siCTL or BM-MSCs-siEPO at a ratio of 1∶15 and treated with CoCl2(0.6 mmol/L)for 24 h.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜0.01 vs CoCl2+BM-MSCs-siCTL.圖3 流式細胞術檢測EPO siRNA對與BM-MSCs共培養的PC12細胞凋亡的影響

Figure 4.Representative photographs and quantitative analysis of apoptotic PC12 cells determined by Hoechst 33258 staining.Arrows indicate the apoptotic cells.Scale bar=50 μm.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜0.01 vs CoCl2+BM-MSCs-siCTL.圖4 Hoechst 33258染色檢測PC12細胞凋亡形態

Figure 5.Effects of BM-MSCs and EPO siRNA on the mRNA expression of Bcl-2(A)and Bax(B)in PC12 cells assessed by RT-PCR.PC12 cells were co-cultured with BM-MSCs，BM-MSCs-siCTL and BM-MSCs-siEPO in the presence of CoCl2(0.6 mmol/L)for 24 h.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜0.01 vs BM-MSCs+CoCl2.圖5 BM-MSCs和EPO siRNA對PC12細胞Bcl-2及Bax表達的影響

5 Caspase-9和caspase-3的活性

PC12 細胞經0.6 mmol/L CoCl2處理 24 h，可觀察到caspase-9和caspase-3的活性明顯增強，與對照組相比，差異有統計學意義(P＜0.01)。BM-MSCssiCTL共培養可以有效抑制CoCl2引起的caspase-9和caspase-3的活性增加(P＜0.01)。EPO siRNA明顯阻斷BM-MSCs介導的caspase-9和caspase-3的活性下降(P＜0.01)，見圖6。這一結果表明:BMMSCs介導的細胞保護作用可能與其下調PC12細胞caspase-9和caspase-3的活性有關。

Figure 6.Effects of BM-MSCs and EPO siRNA on the activity of caspase-9(A)and caspase-3(B)in PC12 cells assessed by fluorometric assay kits.PC12 cells were co-cultured with BM-MSCs-siCTL and BM-MSCs-siEPO in the presence of CoCl2(0.6 mmol/L)for 24 h.Mean± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs CoCl2;△△P ＜ 0.01 vs CoCl2+BM-MSCssiCTL.圖6 BM-MSCs和EPO siRNA對PC12細胞caspase-9和caspase-3活性的影響

討 論

缺血性腦卒中是一種病情嚴重、預后不良的神經系統損傷，也是一個復雜的病理生理過程，包括連續發生的原發性腦損傷和繼發性腦損傷［3］。原發性腦損傷是缺血缺氧后當時被動發生的損傷，主要包括損傷局部神經元、膠質細胞及血管等支持結構的破壞;隨后發生的是長達數日或數周的繼發性損傷，繼發性腦損傷的病理生理過程包括激活多個化學通路如缺血、缺氧、自由基產生、凋亡、變性受體上調及炎癥級聯反應，從而導致在原發性損傷中幸存的損傷區周圍的各類細胞大量死亡，產生比原發損傷更嚴重的影響［3］。大量實驗證實繼發性腦損傷是引起大腦功能喪失的主要原因。因此，恢復缺血腦組織的供血供氧，促進神經功能修復成為缺血性腦卒中治療的首要目標。

BM-MSCs作為一種獲取方便，擴增容易，遺傳背景穩定，免疫原性低的成體干細胞，已被廣泛應用于移植治療缺血性腦卒中［4］。大量研究表明BM-MSCs可遷移至腦損傷局部區域并通過其旁分泌機制增加某些神經營養因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等的濃度，促進缺血性腦卒中的神經功能修復［5］。此外，EPO作為一種造血生長因子，不僅在多種細胞中廣泛表達，而且廣泛參與促紅細胞生成、細胞擴增、血管形成，抗炎及抗凋亡過程［6-11］。生理情況下，EPO含量維持穩定，當受到缺氧性刺激時，EPO表達增加。調控EPO表達的主要元件為缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factors，HIF)。當受到內外源性缺氧信號刺激時，HIF-1α脫離降解，激活EPO基因的缺氧反應元件(hypoxia responsive element，HRE)，從而增強EPO的表達［12］。EPO的主要生理功能是促進紅系祖細胞分裂、分化為成熟紅細胞，以增加循環中紅細胞數量。近年來有研究表明EPO可通過與其受體EPOR結合激活下游Janus激酶2(Janus kinas 2，JAK2)、信號轉導和轉錄活化蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)等信號通路抑制神經元凋亡［13］。Wu等［14］的研究更是表明EPO具有明顯抑制PC12細胞凋亡的作用。PC12細胞作為大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株，具有合成、代謝及運輸神經遞質等特性，已被長期用作模擬神經系統損傷疾病的體外模型［15］。

細胞凋亡過程中，多個信號轉導通路及轉錄因子被激活。其中Bcl-2家族成員被認為是調節線粒體外膜(mitochondrial outer membrane，MOM)通透性的關鍵因子，MOM可通過激活下游caspase-9并最終活化凋亡執行者 caspase-3，從而誘發細胞凋亡［16］。Bcl-2家族成員分為2類，一類具有抑制凋亡作用，如Bcl-XL和Bcl-2等，而另一類具有促凋亡作用，如Bax和Bak等。

在本實驗中我們首先觀察了不同細胞比的BMMSCs共培養對CoCl2引起的PC12細胞活性下降的影響，結果顯示0.6 mmol/L CoCl2處理明顯降低PC12細胞活性，而 BM-MSCs共培養可有效抑制CoCl2引起的PC12細胞活性下降。同時，我們還觀察了0.6 mmol/L CoCl2誘導的BM-MSCs EPO mRNA與蛋白表達情況，結果顯示BM-MSCs經0.6 mmol/L CoCl2刺激后，EPO mRNA與蛋白表達水平明顯上升，而EPO siRNA可有效抑制EPO的表達水平。此外，FCM與Hoechst 33258染色結果表明BM-MSCs共培養減少了CoCl2誘導的PC12細胞凋亡，而這一抗凋亡作用可被EPO siRNA阻斷，提示BM-MSCs介導的細胞保護作用與其上調EPO表達有關。此外，RT-PCR與caspase-9、-3活性檢測結果顯示EPO siRNA可明顯阻斷BM-MSCs介導的Bcl-2表達上調、Bax表達下調及caspase-9、-3活性下降。這些結果表明BM-MSCs的細胞保護作用可能與其上調PC12細胞的Bcl-2表達、下調Bax表達及降低caspase-9、-3活性有關。

綜上所述，本文證實BM-MSCs共培養能有效抑制化學性低氧模擬劑CoCl2誘導的PC12細胞損傷，而EPO可能是介導這一作用的關鍵因子。這為BMMSCs應用于中樞神經系統損傷修復的治療提供了新的實驗依據。

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