MicroRNA-100對肝癌細胞增殖活力和細胞周期的影響*

嵇曉輝， 范秉琳， 張紅鴿， 蔡新華， 朱武凌

(新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉453003)

MicroRNAs(miRNAs)是一類短小(20～24 nt)的非編碼RNA，通過影響mRNA的穩定性和翻譯而參與多細胞生物體中基因表達的轉錄后調控。MicroRNA-100(miR-100)在人類定位于 11q24.1，研究表明它在鼻咽癌、卵巢癌、宮頸癌等多種腫瘤中異常表達，失去對靶基因Polo樣激酶1(Polo-like kinase 1，Plk1)的調控，因而Plk1表達上調，這種改變不僅參與癌的發生過程，而且可能與腫瘤的進展密切相關［1-3］。目前尚不十分清楚miR-100對肝癌細胞的生物學作用及其分子機制，本實驗采用陽離子脂質體Oligofectamine介導，將人工化學合成的miR-100模擬物瞬時轉染人肝癌HepG2細胞中，分析肝癌細胞的增殖活力、細胞周期和Plk1的表達情況，以期能夠揭示miR-100對肝癌細胞的作用與機制。

材料和方法

1 細胞培養

人肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清及1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液，置37℃、5%CO2培養箱培養，選用對數生長期細胞進行轉染實驗。

2 miRNA-100的合成及實驗分組

根據 miR-100的核苷酸序列:5'-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3'，由大連寶生物公司合成帶有熒光素Cy3標記的miRNA-100模擬物以及陰性對照，同時實驗附設單純脂質體對照。

3 細胞轉染

按照陽離子脂質體Oligofectamine試劑(Invitrogen)的操作說明進行，將85 μL培養液Opti-MEM與20 μmol/L miR-100模擬物和陰性對照各5 μL充分混和，與脂質體/Opti-MEM混合物再次混合，將最終混合物加入含新鮮Opti-MEM培養基的肝癌HepG2細胞中，轉染終濃度為100 nmol/L，在37℃、5%CO2培養箱中繼續培養至24 h、48 h和72 h。

4 細胞增殖抑制率測定

細胞培養于96孔板中，5×103cells/well，培養24 h后進行轉染，轉染后24 h、48 h及72 h，加入細胞計數試劑盒8(cell counting kit-8，CCK-8)溶液10 μL后繼續培養3 h，酶標儀檢測波長450 nm處各孔吸光度(A)。細胞生長抑制率(%)=(1－實驗孔A值/對照孔A值)×100% 。

5 流式細胞術分析

于4℃、75%乙醇中固定收集細胞8 h。離心后將細胞重新懸浮于含有200 mg/L RNA酶及15 mg/L碘化丙啶的PBS中，室溫孵育30 min后，通過流式細胞儀(Beckman Coulter)進行細胞周期分析，檢測重復3次。細胞增殖指數的計算方法為:(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)。

6 實時熒光定量RT-PCR檢測

采用 Trizol試劑(Invitrogen)提取實驗各組HepG2細胞的總RNA，紫外檢測儀分別在260 nm和280 nm波長下檢測RNA的濃度及純度。用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA，以此為模板進行實時熒光定量PCR擴增。Plk1上游引物5'-CCTCTCACAGTCCTTAATAA-3'，下游引物 5'-TGTCCGAATAGTCTACCC-3'。實驗同步以 β-actin作為內參照，上游引物5'-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3'，下游引物 5'-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3'。mRNA表達量的分析采用比較Ct數據法(2－ΔΔCt)進行。每組實驗重復3次。

7 Western blotting分析

按蛋白提取試劑盒(Thermo)說明書進行并測定濃度，取60 μg蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后將蛋白轉至PVDF膜。封閉、抗體孵育及顯色按照One-Step Western試劑盒(GenScript)說明進行，Plk1Ⅰ抗(Abcom)工作濃度為1∶600，結果采用Quantity One凝膠圖像處理軟件進行分析。

8 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件包進行分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 肝癌細胞轉染

人工合成Cy3熒光標記的miR-100模擬物轉染HepG2細胞，培養24 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見大部分細胞內有紅色熒光，見圖1，轉染效率大于85%。

Figure 1.HepG2 cells transfected by miR-100 mimic(labeled with Cy3 fluorescent dye).圖1 Cy3熒光標記的miR-100模擬物轉染HepG2細胞

2 肝癌細胞增殖活力

用CCK-8法分析轉染后24 h、48 h和72 h的細胞增殖活力，測得實驗組和對照組細胞450 nm波長處各孔A值，計算出細胞增殖抑制率，見表1。同對照組細胞相比，實驗組細胞在miR-100轉染后各時點的增殖抑制率均顯著升高(P＜0.01)。

表1 HepG2細胞轉染后各檢測時點細胞增殖抑制率Table 1.Inhibitory rate of cell proliferation in transfected HepG2 cells(%.Mean±SD.n=3)

3 細胞周期分析

流式細胞術檢測結果顯示，實驗組細胞在轉染后72 h G0/G1、S和G2/M期細胞分布發生了改變，S期和G2/M期細胞比例下降，其細胞增殖指數(35.8±1.4)較陰性對照組(39.2 ±1.0)和單純脂質體組(40.7 ±2.0)減小 (P ＜0.05)。

4 Plk1表達情況

通過qRT-PCR檢測和Western blotting相對灰度值分析，在轉染后72 h miR-100實驗組癌細胞Plk1 mRNA表達水平較各對照組降低，見圖2，同樣Plk1蛋白表達也明顯減少，見圖3。

Figure 2.Plk1 mRNA expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfected with miR-100 minic for 72 h.Plk1 mRNA expression was determined by real-time RT-PCR.Mean ±SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs blank control，liposome or negative control.圖2 HepG2細胞經轉染后72 h Plk1 mRNA的表達分析

討 論

肝癌在我國是最常見的惡性腫瘤之一，每年因肝癌死亡約11萬人，占全球肝癌死亡總數的45%，嚴重威脅著人民群眾的身體健康。目前在臨床上主要有外科切除、化療、TACE等治療，盡管它們能延長部分患者的生存時間，但是都不能取得滿意的結果。隨著在分子水平上對肝癌研究的不斷進展，基因治療成為臨床應用前景最為看好的靶向治療，尋找基于新機制的治療手段一直是國內外研究的熱點［4-5］。

Figure 3.Plk1 protein expression in HepG2 cells 72 h after transfection.HepG2 cells were transfented with miR-100 minics for 72 h，Plk1 protein was determined by Western blotting assay.A:blank control;B:liposome;C:negative control;D:miR-100.Mean ± SD.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A，B or C.圖3 HepG2細胞經轉染后72 h Plk1蛋白表達分析

近年來研究表明，miRNAs在肝細胞癌中表達異常，導致癌基因的激活上調和抑癌基因的功能缺失，從而調控癌細胞增殖和腫瘤生長［6-7］。Li等［8］分析發現在HepG2細胞中miR-224高表達對細胞增殖、分化及轉移產生影響，但細胞周期并無明顯變化。在本研究中，我們以陽離子脂質體Oligofectamine為介導，用人工合成的miR-100寡聚核苷酸瞬時轉染人肝癌HepG2細胞，旨在揭示miR-100對肝癌細胞的生物學作用。經CCK-8方法檢測發現，miR-100實驗組在轉染后24 h、48 h和72 h的細胞增殖抑制率較其它各對照組均有顯著上升，說明肝癌細胞的增殖活力受到miR-100的影響而減低。同時流式細胞術分析結果顯示，miR-100實驗組的細胞周期分布在轉染后72h發生改變，處于S期和G2/M期的細胞比例下降，細胞增殖指數減小，說明miR-100的轉染引起了肝癌細胞的細胞周期變化。由此可見miR-100參與肝癌細胞的增殖和細胞周期調控。

Plk1是一種有絲分裂調控蛋白，在有絲分裂進展中起到十分重要的作用，其高表達會促進染色體不穩定和非整倍體產生。現已證實Plk1在許多癌癥中異常表達，通過shRNA或化學抑制劑阻斷Plk1的表達或降低其激酶活性，無論是在體外和體內都可以有效遏制細胞增殖和腫瘤生長，更有意義的是，這種抑制作用可優先殺死癌細胞，而對于正常細胞并無大礙［9-12］，因此Plk1成為一個理想的腫瘤基因治療新靶點。本實驗針對Plk1受miR-100調控，運用轉染技術成功建立miRNA干擾模型，經qRT-PCR和Western blotting的檢測分析，結果表明miR-100寡核苷酸轉染抑制了Plk1基因的表達，勢必影響細胞有絲分裂，從而對癌細胞的增殖產生阻滯作用，這為進一步探索肝癌的靶向治療提供了新的途徑。

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