熱處理對食物致敏性的影響及其體外細胞學評價

匡 華， 高畢遠， Yevonne Vissers， 高中山

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.雀巢研發中心營養和衛生部，瑞士洛桑；3.浙江大學 農業與生物技術學院，浙江 杭州310058）

現代生活，食品種類的多樣和生活方式的變革，使得食物過敏發生率呈現上升趨勢。有報道稱，西方國家大約1%～2%的成人和5%～7%的兒童有食物過敏史[1]。中國疾控中心營養與食品安全所的調查表明，我國15～24歲的健康人群中，約有6%的人曾有食物過敏經歷[2]。由于食物過敏與人群年齡、當地食物類型，以及環境氣候等多種因素相關[3]，因此不同地區、不同人群的食物過敏發生率差異較大。如牛奶、雞蛋、花生和海產品食物致敏率為0.1%～10.8%[3]，水果和蔬菜的致敏率為 0.1%～4.3%[4]。過敏反應可以在攝入食物后的幾個小時甚至幾分鐘內發作，因此對于某種食物過敏的人群，其日常生活質量受到很大的影響。目前的研究發現，盡管幾乎所有食物都可能引發過敏反應，但不同食物的過敏原可以歸納為少數幾個蛋白質家族[5]。對于食品過敏性的評價可以分為體內試驗和體外試驗兩種類型，目前大多數采用后者。較為簡便的體外監測方法是基于過敏原-IgE抗體結合的酶聯免疫分析（Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay，ELISA）和免疫印跡。

隨著最近10年里細胞生物學的迅速發展，從細胞和分子水平上研究過敏機理、評估致敏過程已越來越受到關注。例如過敏原的致敏活性可以通過流式細胞儀分析嗜堿性粒細胞特異性啟動標志細胞CD63或者CD 203c的上調來評價，即嗜堿性粒細胞活化試驗 （Basophile Activation Test，BAT）；亦可通過檢測T細胞誘導的免疫反應來進行評價。研究者可以使用同源的或者被動致敏的異源人體嗜堿性粒細胞開展組胺釋放實驗 （Histamine Release Test，HRT）；或者通過細胞過敏原激發試驗（Cellular Allergen Stimulation Test，CAST）檢測肥大細胞白三烯的釋放，以評估過敏原在人血嗜堿粒細胞中的脫顆粒的能力。本文中主要討論食品加工對食物過敏蛋白致敏性的影響，并重點介紹食品致敏性評價中細胞學方法的最新研究進展。

1 食品熱處理對食物過敏原致敏性的影響

現代食品加工不僅要改善食物的顏色、風味、質地等方面的性質，還要著力提高食品的安全性。食物的加工處理會掩蔽或者暴露食物蛋白的抗原表位，影響人體免疫系統對過敏原蛋白的識別和反應，因而導致食物蛋白致敏性的改變。過去20年，科學家們在食物過敏蛋白的分子鑒定方面做了大量研究，這為深入研究食品加工對食物過敏蛋白的理化性質及其致敏性變化奠定了基礎。

1.1 食品基質對致敏性的影響

加工過程中食品基質對過敏原的致敏性有一定的影響。Grimshaw等[6]發現巧克力里的脂肪對食物過敏臨床癥狀反應影響很大。另外，高脂肪含量會影響IgE抗體對花生過敏原的識別，導致ELISA檢測敏感性降低。此研究表明，用于過敏性激發實驗的食品配方（Provocation Recipes）中的脂肪含量很重要，因為它可以影響食物激發病人的臨床反應。由于食品基質脂肪會掩蓋花生過敏原表位，在食物激發試驗中，導致測試方法對口腔和皮試的反應敏感度下降，只有待受試人腸胃消化之后才能檢測到。然而食物激發測試中若用量加大會引發受試人較為嚴重的過敏反應。

通過過敏小鼠模型可以測試食物基質的致敏性。在該模型里，將食品基質充當活化樹突細胞的佐劑。例如，對于花生基質中花生過敏原的致敏性測試，可以選擇一伴隨佐劑，用來活化抗原呈遞細胞（APCs）和誘發隨后的免疫刺激（Stimulation）[7]。 比如：脂肪，會影響蛋白質的抗原反應性[8]；食品基質的水解加工處理中，某些有免疫活性的蛋白其N末端肽鏈解開[8]，或者酶促反應等處理會改變過敏蛋白與IgE的結合活力[9-11]。

1.2 不同熱加工方式對食物致敏性的影響

熱加工是食品加工中常見的方法，加工方法對于食品致敏性的影響因食物、蛋白類型的不同而異。一些引發嚴重過敏的食物蛋白常常結構很穩定，多具有二硫鍵，具有很強的耐酸堿和消化酶特性，加工過程也對它們影響較小。還有一些過敏蛋白的穩定性一般，日常的食品熱加工方法可能破壞或者產生新的表位簇（epitope），從而影響食物的致敏性。如熱加工可導致某些食物過敏蛋白三維構象表位變化，使得其與人IgE結合活性降低，或者由于一些過敏蛋白非常不穩定，經過熱加工使其致敏性喪失；然而熱加工亦可引起蛋白致敏性新表位的產生，或者之前隱藏的蛋白表位暴露，提高了其與IgE的結合能力，將導致食物致敏性的增強。

蝦的過敏原蛋白組分主要是原肌球蛋白，張俊英等研究表明，熱加工可以顯著降低蝦致敏性，80℃水浴加熱10 min的乳清蛋白水解產物中過敏原含量顯著低于未經過加熱處理的乳清蛋白中過敏原含量[12]，烘干處理（105℃烘箱中烘烤2 h）后的蝦免疫活性降低了85%[13]。牛奶的過敏原乳球蛋白在加熱后并沒有完全破壞IgE結合的能力，但是增加了乳清蛋白的體外可消化性，在小鼠模型上發現可以降低鼠嗜堿粒細胞中介質的釋放和嗜堿粒細胞的活化作用[14]。

荷蘭學者Vissers等[15]設計了水煮和烘焙兩種熱加工方法處理花生，并以未加工的花生作為對照，比較花生過敏原致敏性的變化。她分別純化了花生主要過敏原Ara h 1、Ara h 2和Ara h 6，比較了兩種處理方式下過敏原結構的變化，并且評估了其誘導效應細胞分化和細胞因子釋放能力，以及引起IgE結合和交聯的能力。研究發現，對于Ara h 1過敏原而言，水煮法可導致Ara h 1自身聚合，從而降低了與IgE結合和交聯的活性，其致敏T細胞的活性并未受影響。而從烘焙花生中提取的Ara h 1則高度變性，會形成更多的球狀小的聚合物，但其與IgE的結合活性不變。對于Ara h 2和Ara h 6來講，水煮熱加工對于T細胞反應活性沒有影響，但水煮處理降低了這兩種過敏蛋白的IgE結合和交聯能力，從而使其致敏性顯著降低；但從烘烤花生提取的可溶性Ara h 2和Arah6與未加工的沒有差別。

其它常見的食物成分，如大豆提取物，通常包括種子貯藏性11S和7S球蛋白，這些蛋白比較耐熱，這類過敏原通常具有β-桶狀（β-barrel）的蛋白基序（Motif）和高度穩定的結構域特征，在熱處理下僅出現部分和輕微的構象變化[16-17]。7S球蛋白在70～75℃時發生熱轉換，而11S球蛋白則在94℃以上的溫度下解開。Bohel等研究表明，60 min烹飪不同的重組Bet v 1（一種樺樹花粉過敏原）相關過敏原，可以完全消除其與lgE的結合能力，但是并未觀察到該過敏原致敏特異性T細胞活力的降低[18]。

有些食物過敏原蛋白非常穩定，如桃和蘋果等果實中脂質轉移蛋白（LTP），分子量僅為9 kDa，包含4對二硫鍵。研究表明，天然純化的蘋果果實脂質轉移蛋白（Mal d 3，LTP）在含或者不含葡萄糖的基質中熱處理（90℃，20 min）后，其IgE結合活性沒有發生改變。在較高溫度和較長時間（100℃，2 h）處理后，才發生些許結構變化，但其IgE結合活性顯著降低（近30倍）。在葡萄糖存在下進行熱處理，則導致4個葡萄糖分子和1個Mal d 3蛋白分子結合，使得IgE結合活性降低至原來的10%～50%[19]。

由以上研究對比可知，熱加工既可以降低食物過敏原的致敏性，亦可以增強食物過敏原的致敏性，一切因食物蛋白、加工方式和熱加工類型不同而異。

1.3 美拉德（Mail lard）反應對食品致敏性的影響

在食品熱加工過程中，最重要的非酶促化學變化是美拉德反應。過敏原氨基酸的糖基化的程度取決于不同的環境條件，比如溫度、pH、水分活度、加熱時間和存在的還原糖濃度及種類[20]。李慶麗等發現，不同的還原糖對蝦過敏原的免疫活性影響差異很大。實驗表明，在合適的條件下，美拉德反應能夠有效降低蝦過敏原的免疫活性[21]。葡萄糖使蝦過敏原免疫活性降低約10%，麥芽糖能夠使蝦過敏原的免疫活性降低60%。Ilchmann等探索了溫度對美拉德反應的影響，發現高溫導致蘋果果實脂質轉移蛋白（Mal d 3）的致敏性顯著減弱，然而糖化作用則對過敏原起到保護作用。水果中還原糖的存在讓熱加工過程中脂質轉移蛋白（LTP）的過敏活性變得更加穩定[22]。然而對于蕎麥過敏原Fag e 1而言，卻呈相反的現象。Nakamura等研究發現，多糖鏈在Fag e 1表面結合減弱了它的致敏性[23]。同樣地，Iwan等研究發現，60～145℃熱處理，榛子過敏原Cor a 11的糖化作用有可能減弱其與IgE/IgG的結合能力，但是其致敏嗜堿粒細胞的活力不受影響。這有可能與美拉德反應導致的蛋白聚集有關[24]。最近研究表明，水煮花生中加糖與否對致敏性沒有影響[25]。因此，美拉德反應對食物過敏原致敏性的影響與食物的種類有很大關系。

2 食物過敏原致敏性的體外細胞學評價

食物過敏反應是人體免疫球蛋白IgE介導的超敏反應，是一種復發率很高的病理反應。過敏患者受到抗原（或半抗原）的刺激，體內產生相應的抗體或致敏淋巴細胞；當再次接觸同一種抗原后，在患者體內引起體液或細胞免疫應答，導致組織損傷或機體生理機能障礙。致敏過程原理根據Burks A W的附圖、Zhou C和Alexandra Zhernakova的綜述繪制[26-28]，如圖1所示。

圖1 過敏反應機制示意圖Fig.1 Skeptical diagram of the mechanism of allergic reaction

Treg細胞（T調節細胞）有調節降低免疫應答的作用，它由天然的Treg細胞（CD4+）和適應性或者誘導產生的Treg細胞（Tr1）組成。Treg細胞可以抑制抗原產生特異的Th 2和Th 1細胞發育反應，因此在健康免疫應答中扮演了重要的角色[29]。靜默狀態的CD4+T細胞（Th）釋放很少的細胞因子。當受到過敏原和抗原呈遞細胞激發后產生IL-2的狀態稱做Th0，Th0持續受到激發信號后發生極化進程，根據激發位點的細胞因子性質分為Th1、Th2、Th17[30]。

過敏性疾病是由異常T細胞（長壽命的Th2細胞）對過敏原產生應答反應而導致[31]。抗原特異CD4+Th2細胞受到刺激后分泌大量的細胞因子IL-4和IL-13，它們誘導特異性過敏原IgE抗體大量合成。這些IgE抗體繼而介導級聯超敏反應[32-34]。除此之外，抗原特異Th2細胞也會直接參與肺和皮膚器官的遲發型過敏反應[35]。

食品加工對食物過敏原致敏性的影響可以通過多種手段進行分析評價。如通過監測動物過敏模型暴露于潛在過敏原后的病理性反應，來評估該過敏原誘導敏感人群發生過敏反應的能力。用于檢測過敏原和IgE的結合能力的免疫印跡或者酶聯免疫法簡便易行，然而這些檢測方法無法確定過敏原是否可引起嗜堿性粒細胞過敏原特異IgE抗體與受體FcεR1的交聯這一致敏生理過程。

近年來的研究熱點是通過監測T細胞的極化（polarisation）來分析T細胞介導的過敏反應。

該方法從細胞生物學的角度來監測IgE抗體與受體FcεR1的交聯引起效應細胞免疫應答、組胺釋放的能力。研究者可以使用T細胞極化分析來衡量食物中的蛋白質能否啟動CD4+輔助性T細胞以及Th2細胞的活化[28]。研究過敏蛋白的生物活性以及食品加工或者消化對蛋白致敏潛力的影響時，一般使用較為穩定的人化嗜堿粒細胞，而非捐獻血液中初步提取的嗜堿細胞。體外檢測嗜堿細胞脫顆?；蚪M胺釋放，可進行自體或異源人嗜堿細胞系的被動激發試驗?？啥繖z測硫化白三烯（sulfidoleukotriene）的釋放水平來評價食物過敏原導致嗜堿性細胞脫顆粒的能力。另外，食物過敏原的致敏活力測試，還可通過流式細胞儀進行分析嗜堿性細胞活化的標志物CD63或者CD203c分子來進行[32]。

2.1 外周血單細胞（PBMC）模型

外周血單細胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC）可通過外周血的密度梯度分離而獲得。從過敏患者和健康人 （對照）身上抽血，菲可（FICOLL，葡聚糖）密度梯度離心后，頂層清液含有血漿和血小板，第二層是PBMC層，第三層是聚蔗糖和粒細胞，第四層含有血紅細胞。PBMC包括T細胞和B細胞、自然吞噬細胞和單核細胞。

T細胞極化分析是基于人的PBMC的培養而進行的。T細胞的啟動需要至少兩個信號：主要組織兼容性復合體－多肽與T細胞受體（TCR/CD3）相結合信號以及抗原呈遞細胞（APC）表達的CD28結合B7－1/2（CD80/CD86）發出的第二個信號（因此被稱為共刺激信號）[36]。在PBMC培養液中加入過敏原后，過敏蛋白經過APC呈遞給適應性免疫應答細胞。隨后經過級聯反應而誘導T細胞的活化和特殊細胞因子的生成[37]。通過監測淋巴細胞表面標記，結合多色流式細胞染色技術，可以分析PBMC培養液中的細胞表型。分離血液中PMBC部分后，可采用特定細胞表面抗原的特異性單克隆抗體如αhCD3，α -hC4，α -hCD8，α -hCD25，α -hCD14，α -hCD16，α-hCD19 和 α-hCD56[35]等進行特定細胞染色，采用流式細胞儀分析。此外，還可采用細胞因子來校準T細胞的數量。

2.2 細胞培養基質以及新鮮或凍存PBMC選擇

對于免疫應答過程而言，在接受抗原刺激1～2 d的階段為先天固有（innate）反應（特異單核細胞應答）階段，接受抗原刺激5～7 d后是適應免疫系統應答（特異T細胞應答）階段。PBMC模型的優點在于可在不同時間階段測定特定細胞的應答反應，實驗結果可以歸因于先天固有的和適應性免疫反應所產生的特定細胞反應。它的缺點是血液中的特異抗原致敏產生的淋巴細胞濃度常常很低，抗原特異激發后很難觀察到效果。另外，PBMC群體因人和取樣日期而異，因此需要格外精心控制。建議統一取樣和測試方法，如用新鮮或者冷凍保存的細胞、相同的培養基和同樣的儀器系統，以及用相同的測試時間點。

Yessel培養基是一種基于伊思考夫改良后的杜爾貝可培養基（Iscove's Modified Dulbecco's Media，IMDM），不含血清。采用Yssel培養基可以較好地呈現PBMC表達細胞因子的水平。單細胞可以成功超低溫保存，恢復率50%～75%。

2.3 細胞因子的產生和擴增

食物過敏患者的T細胞受到過敏原活化并分化會產生一組典型的細胞因子IL-4、IL-5和IL-13，它們是Th2淋巴細胞活化的標志性細胞因子。因此，可以通過對特定的細胞因子的分泌情況進行檢測。可采用多重微珠流式細胞儀（BD Bioscience）測定細胞上清液或者血清，抑或用ELISA來測定特定的細胞因子。但這些方法不能判斷活化的細胞類型及其比例。使用細胞表面標記物的多重熒光染色結合細胞內細胞因子的染色的方法，可以確定細胞亞型及其分泌的特定細胞因子。該方法可以在單細胞水平上提供更有價值的信息。因為每個刺激物產生不同的細胞動力學反應和細胞因子，可以方便地優化不同細胞因子的最佳刺激時期。

2.4 食物過敏原對特異致敏淋巴細胞的影響

血液中的特異致敏淋巴細胞的比率一般較低。如樺樹花粉過敏原Bet v 1特異CD4+T細胞在非樺樹花粉季節的水平約為CD4+T細胞總數的十萬到百萬分之一（過敏和正常人群），在花粉季節上升到千分之一[37-38]。此外，不同過敏原致敏特異性T細胞能力也差異很大。由于致敏細胞低豐度的特點，使得通過特異抗原的激發試驗很難觀察到顯著的細胞增殖和細胞因子水平變化。尤其對于低、中程度的過敏患者的樣本，很難發現致敏性淋巴細胞的應答變化，因而常采用多克隆共刺激物來放大應答反應。

3 結語

我國在食物過敏原以及加工后食物過敏原致敏性的評價方面目前大多是基于提取物和特異性IgE的體外檢測技術，而對于過敏蛋白組分分離鑒定和細胞學致敏性檢測方法已經在西方國家獲得應用。與國內現行的ELISA相比，基于細胞學的過敏原分析可以檢測過敏反應誘導的T細胞級聯反應，而非單單地檢定過敏原與IgE抗體的親和程度。本文對外周血細胞過敏模型的介紹可為研究食物過敏以及評估潛在食物過敏原提供參考。

致謝：本文部分內容源于Vissers Y M，Wichers H J， Savelkoul H F J的 文 章.Influence of Food Processing， Digestion and the Food Matrix on Allergenicity&Cellular Measures of Allergenicity，見Gao Z S，Shen H H，ZhengM 等 所 編 。Multidisciplinary Approaches to Allergy一書，由杭州浙江大學出版社2012年出版，第203-227頁。感謝浙江大學出版社！江蘇大學董英教授對文稿提出了修改建議和專業指正，對此表示衷心感謝！

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