督脈電針對大鼠急性脊髓損傷6h后Nestin表達的實驗研究

北京中醫藥大學（100029）宋萌 王遠征 時素華 李志剛

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是指由于外界直接或間接因素導致脊髓在損害的相應節段出現各種運動、感覺和括約肌功能障礙。近年來，SCI的治療取得了長足的進步，且電針治療SCI已得到醫學界廣泛的認可，但其具體作用機制尚不完全清楚。督脈電針是電針中最常用的一種，治癱首取督脈[1]。本研究通過觀察急性SCI后Nestin的表達，探討針刺治療急性SCI的作用機制，以期為臨床針灸治療急性脊髓損傷后提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SD大鼠32只，體重240±20g，由北京維通利華動物中心提供。隨機分為空白組、模型組、電針組和藥物組，每組8只。

1.2 針具 針灸針用華佗牌無菌針灸針，規格：0.30×13mm。電針用韓氏（HANS）電針儀，型號LH-202H。

1.3 模型制作 用10%的水合氯醛3.5mL/kg行大鼠腹腔麻醉，固定于弓形手術臺上。按大鼠背部最下端肋骨緣橫對T13為標志，向上依次定位T9～T11。背部脫毛后分離肌肉；用刀片自棘突向兩側剝離椎旁軟組織，暴露T9～T11段棘突和椎板；彎眼科剪剪除T10椎板及其上關節突和下關節突，暴露脊髓；參照經典Allen’s打擊法，打擊T10段脊髓5cm×10g。模型成功的標準：鼠尾持續劇烈擺動數秒，雙下肢及背部肌肉收縮，硬脊膜下出血，大鼠麻醉醒后雙下肢不完全癱瘓。

1.4 治療 電針組于造模后即大鼠蘇醒后先CBS評分，再選取“大椎”、“命門”進行針刺治療，進針約0.5～0.7cm。使用韓氏LH-202H電針儀，大椎接陰極，命門接陽極，持續脈沖電流，2Hz，治療20min。藥物組于造模后以30mg/kg體重的甲基強的松龍尾靜脈注射。空白組和病理組不做任何治療，但要在同一時間均抓取一次。

1.5 取材 造模后6h大鼠麻醉，行心臟灌注術：開胸暴露心臟，行左心室、主動脈插管，剪開右心耳，灌注生理鹽水200mL，灌注8%多聚甲醛的磷酸緩沖液300mL固定至動物肢體僵硬后，以撞擊點為中心，取出損傷部位（節段T9～T11）及其近、遠端各2個節段，約1cm長脊髓浸入固定液。

1.6 檢測 將組織經固定液固定、沖洗、梯度脫水、浸蠟、制石蠟切片（厚度6μm）進行Nestin表達檢測：下行脫水，雙蒸水洗滌；加入0.3%的過氧化氫甲醇溶液30min，雙蒸水清洗5min×2 ；枸櫞酸鈉緩沖液PBS洗10min×3；加入羊血清1～2滴，37℃溫箱存放30min；吸干羊血清，加入稀釋的一抗，保濕盒中4℃，36h；將保濕盒移入溫箱（37℃）1h，PBS洗5min×3；加入二抗，室溫孵育2h，PBS洗10min×3；加入三抗，室溫孵育2h，PBS洗10min×3；DAB顯色：加入顯色液，不超過30min，待細胞著色而背底顏色較淡時吸去顯色液，PBS洗10min×3；梯度酒精脫水之后，中性樹膠封片。

1.7 統計分析 統計分析采用軟件進行。所得數據以均值±標準差（±s）表示。組間比較采用方差分析。以P＜0.05作為統計學差異顯著性的標準，P＜0.01為差異極顯著標準。

2 結果

Nestin在細胞胞漿中表達為棕褐色顆粒，主要集中于脊髓中央管室管膜、脊髓背側出血壞死區。空白組僅見少量巢蛋白陽性細胞（見附圖1）；模型組、電針組與藥物組在脊髓損傷后6h巢蛋白陽性細胞數增加（見附圖2、3、4和附表）。

3 討論

中醫學認為脊髓損傷后所產生的各種癥狀，乃因瘀阻督脈，樞機統帥失職，三陽經氣血逆亂而致。其病因為“瘀血”，病機為“督脈樞機不利”。因此，在治療上應以疏通督脈以壯一身之陽氣，使氣血調達、氣機調暢。而督脈電針能夠疏通督脈，溫腎壯陽，活血化瘀，使陽氣通達全身，使精血養四肢而恢復機體的各項功能。實驗中也證實督脈電針可以起到對脊髓神經的保護作用和促進脊髓神經的再生作用[2]。

附表 陽性細胞表達陽性區域面積（±s，μm2）

附表 陽性細胞表達陽性區域面積（±s，μm2）

注：與空白組比*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

動物分組 數量（n） SCI后6h Nestin的表達空白組 8 31.280±20.678模型組 7 248.815±83.982**藥物組 7 596.030±153.854**▲▲電針組 8 605.322±167.541**▲▲

附圖2 6h模型組（50μm）

附圖3 6h電針組（50μm）

附圖4 6h藥物組（50μm）

本實驗觀察到電針能促進急性脊髓損傷后Nestin大量表達。而Nestin是神經干細胞的標記蛋白[3]，往往與細胞的分化狀態有關，這就表明電針對神經干細胞有很強的增殖作用。本次實驗發現，與模型組比較，6h電針組和藥物組的傷段脊髓組織Nestin含量都升高，有顯著性差異（P＜0.05），電針組和藥物組之間Nestin含量無統計學差異。模型組Nestin陽性細胞少，這可能是神經干細胞在SCI病理情況下的反應性增殖，以彌補神經系統組織學缺失。因此，成年哺乳動物體內存在的神經干細胞可能參與損傷過程的神經元再生和組織修復。

本實驗Nestin的數據結果提示電針對大鼠SCI后神經功能有保護作用，電針提高了Nestin含量即促進了神經干細胞增多來起到促進SCI再生修復和功能恢復的作用。其參與機制可能有以下幾點：①電針促進神經細胞的代償性修復，減輕神經功能缺損以及病理損害程度；②電針治療早期SCI，即急性期SCI，可顯著改善損傷局部的血流量，提高神經營養因子的表達[4]，促進神經干細胞增殖[5]，清除氧自由基。這提示電針既能激發內源性神經干細胞的增殖，使其與神經系統生長發育有關的巢蛋白的表達保持在較高水平，又能改善損傷局部微環境，促進神經營養因子的分泌；③督脈電針可能通過促進受損傷脊髓組織細胞的代謝過程，引起細胞膜的腺苷酸環化酶活性升高，使ATP生成cAMP增加，從而激活了神經元和神經膠質細胞內蛋白激酶A的級聯反應，啟動細胞生長因子和神經營養因子等蛋白質的合成和分泌過程，從而促進脊髓內移植的神經干細胞存活和分化，以及促進受損傷神經元的存活及其軸突再生，重建神經通路，恢復脊髓的功能[6]。

SCI損傷后的再生修復是一個非常復雜的過程，電針在誘異脊髓損傷后神經干細胞增殖和分化上顯示出巨大的潛力，標記神經干細胞增殖和分化的Nestin也不容忽視。隨著對神經干細胞作用研究的不斷深入，督脈電針對急性脊髓損傷后的治療方面必將顯示出更為廣闊的前景。