光學分子成像技術研究伏馬毒素B1誘導植物光依賴性超敏反應的機制＊

邢富強，曾禮漳，孫愛珍，邢 達

(華南師范大學激光生命科學研究所暨教育部重點實驗室，廣東廣州 510631)

0 引言

環境脅迫經常會影響到植物的正常生長發育過程，同時植物也會對環境影響做出相應的反應，這就是植物與環境的相互作用。植物在與病原菌的互作過程中，含無毒基因(Avr)的病菌侵染植物往往會出現超敏反應 (hypersensitive response，HR)，超敏性細胞死亡是植物抗病性的一種常見反應，植物通過這種方式可以抵御外源病原菌入侵，抑制病原菌在植物體的進一步擴散［1，2］。病原激發子 (elicitor)本身是一類來自于病原物，能夠作用于植物并誘導植物產生HR的物質，作為病原菌的可致病性的毒素成分，可以應用于病原菌脅迫對植物體致病機理的研究中［3-5］。伏馬毒素B1(FB1)是由串珠鐮刀菌分泌的效應因子，作為病原激發子能夠引起玉米等大量作物的病害減產［6］。有報道指出，FB1對人、畜也是一種潛在的致癌物，動物試驗和流行病學資料已表明，FB1能夠損害肝腎功能，引起馬腦白質軟化癥和豬肺水腫等［7］，現已引起世界范圍的廣泛注意。目前，研究發現丁香假單胞菌，串珠鐮刀菌等多種病原菌都可以引起植物出現光依賴性的HR程序性細胞死亡［8，9］，葉綠體作為植物吸收和轉化光能的細胞器，推測葉綠體在HR過程中發揮著重要的作用?；钚匝?ROS)爆發通常被認為是植物與病原菌的互作過程中植物對病原菌的早期反應之一［10］。目前有研究認為ROS產生的作用主要有:首先ROS具有抵抗微生物對植物入侵的作用，ROS在殺死入侵微生物的同時能夠抑制病原菌的生長和繼續擴散。此外，ROS在病原菌入侵或者植物受到逆境脅迫時還能夠作為信號分子，通過信號級聯放大誘導植物抗病相關基因的表達以及生成次生代謝產物，進而提高植物的抗病能力。但ROS是否參與FB1誘發的光依賴性的HR過程以及ROS的具體調控機制仍不清楚。

本文利用葉綠素分子的天然探針特性以及使用H2DCFDA，綠色熒光蛋白(GFP)等光學分子標記，采用光譜分析和熒光檢測技術手段，通過比較固定熒光產量(Fo)，最大熒光產量(Fm)，最大光量子產量 (Fv/Fm)，實際量子產量Y(Ⅱ)，研究了伏馬毒素B1侵染對擬南芥葉片光合效率的影響。同時，植物葉綠體基質定位標記GFP后，在體無損觀測了葉綠體基質蛋白在FB1處理下的形態生理變化。GFP是從一種從水母體內發現的發綠色熒光的蛋白。可用于特定蛋白和各種細胞器的標記定位，如線粒體、葉綠體、細胞骨架、細胞核等等［11］。GFP標記細胞器后，可以被用來檢測細胞內Ca2+、pH、電勢、金屬酶活力以及細胞器的形態與運動［12］。借助激光共聚焦顯微鏡觀察，初步研究了FB1誘導的擬南芥葉片光依賴性HR早期引起細胞死亡的早期信號事件，檢測了ROS信號分子的產生及亞細胞定位，細胞器形態和功能的改變，從而為今后深入開展植物光依賴性HR的機制研究提供一定的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 哥倫比亞野生型擬南芥 (ecotype Columbia，Col)種子先在4℃春化處理2-3天，然后在人工氣候培養箱 (E7/2，Winnipeg，Canada)土培，光周期為 16 h/8 h(光/暗)，晝夜溫度:23℃/21℃ (晝/夜)。CT-GFP轉基因種子 (Maureen R.Hanson教授惠贈)。生長三周至四周的擬南芥植株用于實驗。

1.1.2 主要試劑和儀器 伏馬毒素B1購于上海Sigma，熒光染料 H2DCF-DA(Eugene，OR，USA)工作濃度為5μmol/L，其它普通化學試劑均為國產。激光共聚焦顯微鏡 (LCSM 510/confoCor2，Zeiss，Germany)，調制葉綠素熒光儀Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometer(Walz，Effeltrich，Germany)。

1.2 方法

1.2.1 FB1侵染 選取生長至四周并且狀態良好的擬南芥葉片用于實驗。以等量的含0.01%甲醇的水作為空白對照，10μmol/L FB1樣品 (用0.01%甲醇溶解)噴灑后的植株放在人工氣候培養箱中保持濕度培養。

1.2.2 原生質體的提取 方法參考張玲瑞等［13］，生長三至四周齡的擬南芥葉片，先在無光條件下適應2 d以消除光對植物的影響。用鋒利的刀片將葉片切割成0.5-1.0 mm的小條。置于2.5mL酶解液(1%-1.5%的纖維素酶 R10，0.2%-0.4% 的離析酶R10，0.8 mmol/L 甘露醇，500 mmol/L KCI，100 mmol/L MES，100 mmol/L CaCl2)中，抽真空處理 0.5 h 后，放置在黑暗條件下酶解3 h。用孔徑為35-75μm的尼龍網過濾，100 g離心力下離心3 min，棄上清，將下層原生質體小心的重新懸浮于W5(500 mmol/L KCI，100 mmol/L MES，500 mmol/L CaCI2，l mmol/L NaCl)溶液中，懸浮濃度為2×105個/mL。

1.2.3 葉綠素熒光成像觀測與分析 采用調制熒光成像系統Imaging-PAM Chlorophyll Fluorometer(Walz，Effeltrich，Germany)測定不同處理下的擬南芥葉片葉綠素熒光參數。測定前，葉片先暗適應20 min，每隔 0.5 h 測定一次，得到 Fo，Fm，Fv/Fm，Y(Ⅱ)。測量光頻率為 1 Hz，強度 0.5μmol/m2·s，光化光強為 165μmol/m2·s，持續 10 min;飽和脈沖強度為 2500μmol/m2·s，持續 0.8 s。

1.2.4 激光共聚焦顯微觀察 激光共聚焦顯微鏡(LSM 510 META，Carl-Zeiss，Jena，Germany)，實驗用488 nm氬離子激光作為激發光源，GFP自發熒光和DCF熒光以500～550 nm的帶通濾光片探測，葉綠體自發熒光650 nm的長通濾光片探測。物鏡為40倍的油鏡。圖像及其數據使用軟件Zeiss Rel 3.2系統進行分析。

2 結果與分析

2.1 伏馬毒素B1對葉片光化學效率的影響

一般情況下，10μmol/L FB1處理擬南芥葉片需要4天才能出現肉眼可見的HR癥狀。本文使用FB1處理2天的葉片檢測了光化學效率。從圖1看出，光暗條件顯著影響了葉綠素熒光各個參數的變化。Fo代表不參與PSⅡ光化學反應的光能輻射部分，是PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量，在逆境條件下會升高。Fm是PSⅡ反應中心處于完全關閉時的熒光產量，可反映通過 PSⅡ的電子傳遞情況，Fm的下降表明植株的最大熒光效率下降。Fv/Fm是PS II潛在最大光合效率，即PS II最大量子產量，在逆境脅迫下一般會下降。Y(Ⅱ)反映了PSⅡ反應中心內的光能轉換效率，該參數在正常條件下變化極小，不受物種和生長條件的影響，在逆境條件下會明顯下降。在本文實驗中，Fo的增加代表 PSⅡ反應中心出現可逆的失活或不易逆轉的破壞，說明經FB1侵染過的擬南芥葉片，其PSⅡ反應中心受到了損傷。Y(Ⅱ)的減少表明PSⅡ反應中心內光能轉換效率降低，導致光合電子傳遞紊亂，葉片的光合作用被顯著抑制，光合效率降低。因此，實驗結果表明了光參與促進FB1對葉片光合系統的損傷和光合作用的抑制過程，進而推動葉片HR的形成。

2.2 光依賴的ROS產生及其亞細胞定位

活性氧 (ROS)主要包括超氧陰離子，過氧化氫等。在病原菌與植物的互作過程中，ROS爆發通常被認為是植物對病原菌刺激的初期反應事件，從而對植物細胞造成損傷，導致細胞發生程序性死亡。因此，我們從擬南芥葉片中提取出原生質體，觀察了200 nmol/L FB1處理后細胞ROS的產生情況，ROS的產生可以用熒光探針H2DCFDA監測［14］。先將熒光探針H2DCFDA于原生質體預孵育20 min，然后加FB1在光暗條件下共聚焦觀察ROS的產生 (圖2)。實驗結果發現，在處理30 min內，FB1+Light處理組產生ROS的細胞逐漸增多，而暗處理和對照組則基本不變化或只有微小的上升，說明FB1誘導的ROS產生是光依賴性的 (圖2A)。通過單細胞定位觀察，DCF熒光和葉綠體自發熒光區域是重疊的，說明ROS產生主要來自于植物細胞的葉綠體 (圖2B)。以上實驗表明FB1誘導的擬南芥葉片原生質體ROS產生是光依賴性的，并且主要來源于細胞的葉綠體中。

2.3 ROS參與促進葉綠體降解

由圖3可見，對照組在40 h時，GFP標記的葉綠體基質蛋白基本無變化，而FB1處理組中，隨著處理時間的延長，GFP熒光呈現出了明顯下降的趨勢，說明FB1處理能明顯增加了葉綠體GFP標記蛋白的降解過程。由于ROS在啟動和調節細胞PCD過程中起到了重要的作用，因此我們推測其降解機制可能是由于ROS的積累作為FB1處理作為刺激的初期反應事件而引起的。因此，我們使用了ROS清除劑過氧化氫酶(CAT)和抗氧化劑抗壞血酸 (AsA)觀察ROS產生對葉綠體降解的影響。CAT的主要作用是將過氧化氫分解代謝［15］，清除植物體內的 ROS，抗壞血酸則是起到抗氧化作用。結果發現，FB1+CAT和FB1+AsA處理組的GFP熒光下降速度減緩，說明CAT和AsA預處理后能明顯抑制了FB1誘導的葉綠體蛋白降解過程，從而維持了葉綠體維持正常的形態和生理功能。在FB1誘導的植物HR中，ROS能誘導植物細胞發生細胞程序性死亡和葉綠體降解，并且隨著誘導時間的增加會加快細胞死亡，進一步證實了ROS的產生是導致細胞程序性死亡的重要因素。

圖1 A.光暗條件對FB1誘導的擬南芥葉片葉綠素熒光參數影響的照片;B.定量測定光暗條件下FB1誘導的葉綠素熒光參數的變化Fig.1 A.Chlorophyll fluorescence image of Arabidopsis leaves after infected by FB1 in the presence or absence of light.The false colour code depicted at the bottom of each image ranged from 0.000(black)to 1.000(purple);B.Quantitative analyses of changes in various chlorophyll fluorescence parameters induced by FB1 in the absence or presence of light.Each value was the mean ± S.D.of five independent leaves

圖2 A.FB1誘導的擬南芥細胞光依賴性的ROS產生;(標尺=100μm);B.DCF熒光的亞細胞定位。(標尺 =20μm)Fig.2 A.FB1-induced ROS production is light-dependent in Arabidopsis cells;(Scale bars=100μm)B.The subcellular localization of DCF fluorescence.(Scale bars=20μm)

3 討論

葉綠素熒光動力學技術在研究植物葉片的光合作用過程中對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面有在體、無損、快速的特點［16-19］。本文的葉綠素熒光成像檢測結果表明在光參與FB1誘導HR過程的前期，葉綠素熒光參數Fo升高，而Fv/Fm，Y(Ⅱ)以及Fm則明顯降低，說明了在光參與下FB1抑制了葉綠體的光合效能，對光合系統的損傷最為嚴重，所以植物光依賴性的HR過程與光合系統受損具有明顯的相關性，為研究病原激發子誘導光依賴性HR的機制開拓了新的思路。

圖3 FB1誘導的擬南芥葉片葉綠體產生的ROS對GFP標記的葉綠體蛋白的影響。(標尺=50μm)Fig.3 Effects of chloroplastic ROS induced by FB1on the chloroplastic GFP protein in Arabidopsis leaves.(Scale bars=50μm)

本文實驗結果發現，FB1促進了光依賴性ROS的產生，并且主要來源于葉綠體(圖2)，作為病原激發子FB1誘導的前期事件，這種光依賴性產生的信號分子作為啟動超敏性細胞程序性死亡的前期信號可能是在葉綠體光合電子傳遞鏈受損后過剩能量引發電子泄露產生。從實驗數據可以看出 (圖1，2)，FB1侵染葉片后導致的ROS迸發，與光合系統受損也有明顯的相關性。在植物受逆境脅迫情況下，一定劑量的ROS產生可以作為信號分子起到信號傳遞功能［20］。本文實驗結果發現 (圖3)，FB1明顯促進了GFP標記的葉綠體基質蛋白的降解，而過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸(AsA)的預處理則抑制了這一過程。由于GFP相對較小，只有238個氨基酸，將其與其他蛋白融合后不影響自身的發光功能，通過葉綠體帶GFP蛋白的葉片實時觀測FB1脅迫對葉綠體形態變化的影響，加深了我們對細胞內一些過程的了解，推動了葉綠體凋亡途徑的研究。

本研究使用光學分子成像技術，為揭示病原激發子誘導的植物光依賴性的HR的機理，尤其是從分子水平闡明植物在病原激發子誘導下HR的機理提供理論基礎，將有助于進一步了解植物在受周圍環境脅迫下的各種生理現象的本質，對指導農業生產具有深遠意義。

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