人血清白蛋白藥物輸運過程中的催化作用研究＊

魏言春，宋佳興

(華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學研究所、暨激光生命科學教育部重點實驗室，廣東廣州 510631)

許多小分子藥物可以高親和性地與血漿蛋白可逆結合。這種結合可以延長藥物分子在血液中的循環壽命，有利于藥物的輸運，同時也減少了具有藥理活性的游離藥物分子的濃度，起到“緩釋”作用［1，2］。另外，與蛋白質結合對于那些在血漿中溶解度非常低的藥物的輸運也尤為重要。但結合有時也會對藥效的發揮產生不利的影響，甚至導致藥物的變性和失效［3］。因此研究結合影響藥物功能發揮的原因，不僅對于揭示體內的藥物動力學問題，指導合理用藥具有一定意義，同時對于進行藥物分子設計、開發新藥，也具有重要的指導意義。

藥物和蛋白的結合雖然不是特異性的，不像受體配體結合那樣專一，但蛋白和藥物分子的結合都發生在相對穩定的結合部位并伴隨一定程度的構象變化［4，5］。人血清白蛋白(HSA)是人血漿中含量最為豐富的蛋白質，是最為重要的藥物結合蛋白。HSA分子包括三個結構上相似的功能域(domainⅠ，Ⅱ，Ⅲ)，每個功能域又包含兩個相似的螺旋結構的亞域(subdomainA和subdomainB)，六個亞域聚集在一起，形成了一個不對稱的心型分子［6，7］。研究表明藥物在HSA上的結合部位有三個包括Ⅰ:吲哚及苯二氮卓結合部位;Ⅱ:華法令及阿扎丙宗結合部位;Ⅲ:洋地黃毒甙結合部位。

1992年，Carter在報道HSA的高分辨晶體結構的同時，也報道了幾種配體與 HSA結合的情況［8］。他們指出HSA上的亞域ⅡA和ⅢA上的疏水腔是其主要的配體結合部位。HSA能夠和許多藥物結合，研究表明有些藥物和HSA結合能夠促進藥物的傳輸和藥效的發揮，但也有些藥物會因為這種結合降低了藥效。許多藥物在進入人體后都會產生各種不良的反應，而不良的反應的原因至今許多仍不清楚［9］。

小分子探針海瑩熒光素類似物FCLA是一種活性氧化學發光探針，它可以和活性氧反應并產生化學發光。報道表明HSA能夠影響FCLA的氧化反應過程，顯著增強化學發光強度［10，11］。蛋白和藥物的相互作用可以通過結合影響藥物作用強度和時間的長短，進而對藥物的吸收、分布、排泄及其他方面產生重要作用，從而影響其生物活性的發揮，本研究中則運用可產生化學發光標示氧化反應狀態的化學發光探針FCLA分析研究HSA對藥物產生影響的可能機制，從而進一步揭示體內藥物動力學過程。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

PBS配制 FCLA(Tokyo Kasei Kogyo Co.，Tokyo，Japan)母液 100μmol/L HSA(purity 96% ，Sigma，St.Louis，Missouri)母 液 50μmol/L，光 敏 劑 (PPIX，50μmol/L，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，Wisconsin)置于-4℃冷藏待用。等溫滴定量熱儀ITC購于MicroCal，MA，USA，型號為VP-ITC.該儀器可測量的溫度范圍為2～80℃，最小可檢測熱效應0.125 μJ;等溫數據由計算機自帶的 origin 7.0軟件進行分析、擬合。激光器為635 nm，semiconductor laser，NL-FBA-2.0-635，nLight Photonics Corporation，Vancouver，WA，購自美國。單光子計數儀 PMT，Model MP 952，PerkinElmer Optoelectronics，Wiesbaden，Germany。熱電偶溫度檢測儀:51Ⅱ，Thermometer，Fluke，購自美國。

1.2 等溫滴定

整個實驗溶液溫度為25℃展開實驗。實驗前對 600μL FCLA(50μmol/L)和 2mL 的 HSA(10μmol/L)脫氣10 min;化合物泵入自動注射器中，向反應池(1.458mL)的HSA滴定.每次滴定10μL的化合物，共計30次滴定，首次滴定延遲60 s，兩次滴定時間間隔為240 s，注射針攪拌速度為416 r/min。FCLA和HSA兩者結合的熱效應要扣除FCLA自身的稀釋熱。

1.3 HSA對FCLA氧化反應的增強作用

FCLA(10μmol/L)自氧化檢測及加入 HSA(10μmol/L)后FCLA的自氧化光子計數測量。檢測時間為1 min。配制光敏劑(PPIX，5μmol/L)、HSA(10μmol/L)、FCLA(10μmol/L)的溶液 2mL 在激光(635 nm，50 mW/cm2)的照射下用單光子計數儀(Filter，bandpass 530 nm)產生的化學發光。以及FCLA加入滅活的(10μmol/L，80℃水浴15 min)和新鮮的HSA(10μmol/L)的化學發光。檢測時間1 s。實驗重復三次。

1.4 HSA對FCLA氧化反應速度影響實驗

將HSA母液稀釋成不同濃度的溶液(0-2.5μmol/L)取 2mL分別至于玻璃平皿中。加入 100μmol/L FCLA 200μL，吹打均勻后立即檢測光子強度。實驗重復三次。

1.5 溫度對催化氧化反應速度的影響

將 FCLA(10μmol/L)溶液和 FCLA(10μmol/L)+HSA(10μmol/L)溶液2mL分別置入玻璃平皿，用電加熱器底部均勻加熱，并同時熱電偶溫度檢測儀測量溫度。為了獲得較低溫度起點，溶液和玻璃皿均預冷至4℃。在加熱的同時用光子計數器記錄發光強度變化。

2 結果

圖1 25℃時HSA與FCLA在緩沖液中結合的等溫滴定圖.FCLA，50μmol/L;HSA，10μmol/L;每次滴定10μL，共滴定30次Fig.1 Representative ITC profiles for the titration of FCLA(50μmol/L)into HSA(10μmol/L)at the temperature of 25 ℃ .Everytime 10μL for 30 times.

等溫滴定量熱法(ITC)是用于測量分子間相互作用的方法，已在生命科學、生物物理、物理化學等領域得到廣泛的應用［12，13］。它獨一無二的優勢在于單次實驗即可得出完整精確的熱力學參數，包括結合位點數N、親和常數Kb、焓變△H、熵變 T△S、吉布斯自由能△G。圖1為原始滴定等溫線，實驗結果數據分別為，N:0.825;Kb:6.77 ×105 L mol-1;△H:5.707 kcal mol-1;T△S:13.877 kcal mol-1:△G:-5.661 kcal mol-1。數據表明25℃溶液中，HSA和FCLA兩者在滴定混合中有一個自發結合的過程(△G＜0)并且吸熱，結合能的變化則證實了二者的結合。

圖2 HSA對FCLA化學發光的增強作用。圖A:FCLA(10μmol/L)自氧化及 HSA(10μmol/L)對FCLA的自氧化增強。圖B:在光敏反應產生的大量活性氧(PPIX，5μmol/L)的刺激下FCLA的化學發光。滅活的和新鮮的HSA(10μmol/L)分別被加入到反應液中Fig.2 FCLA Chemiluminescence is enhanced by HSA.A:The self oxidation of FCLA(10μmol/L)and the enhancement by HSA(10μmol/L).B:Large amount of reactive oxygen is produced to excite chemiluminescence of FCLA.The active and inactive HSA is added in the solution

圖2表明HSA顯著地提高了FCLA的化學發光。實驗數據表明，在有氧的條件下，單獨的HSA不能發光，而單獨的FCLA由于自氧化可以產生微弱的發光。但是當HSA加入FCLA溶液時其化學發光被顯著地提高。表明FCLA自氧化反應的活化能閾值被HSA降低了。因此，HSA必然和FCLA存在一個物理結合反應，正是這種結合引起的相互作用最終導致FCLA氧化閾值的降低。

為了進一步驗證和檢測HSA和FCLA的結合效應，HSA經高溫破壞了其生物活性結構，蛋白三級結構解散。圖二B可以看到在FCLA強氧化實驗中，有活性的HSA明顯提高了化學發光的強度，而滅活的HSA反而降低了化學發光。

圖3 HSA濃度對氧化反應速度影響。將不同濃度的HSA溶液(0-2.5μmol/L)2mL置于玻璃皿中，加入100μmol/L FCLA 200μL，檢測光子強度。數據點用直線擬合 (R=0.92609)Fig.3 The influence of HSA concentration to oxidation reaction.2mL different HSA concentrations were transmitted in glass vessel，200μL FCLA(100μmol/L)was then added in.Emitted photons were detected.The data were fitted by linear(R=0.92609)

酶解過程是酶與底物結合后引起反應活化能的降低從促進了反應的進行。而酶催化的基礎是和底物的結合，圖二的結果恰恰表明了這種結合。根據酶催化理論，酶濃度對反應速度有影響:當反應系統中底物的濃度足夠大時，酶促反應速度與酶濃度成正比，即ν=k［E］。因此我們考察了HSA濃度的變化對FCLA反應速度的影響。圖三中，當反應系統中底物(FCLA)的濃度足夠大時，FCLA的反應速度和HSA的濃度成正比關系。實驗結果表明，作為生物活性大分子，白蛋白和FCLA結合后具有提高氧化反應速度的作用，類似酶的作用。

為了進一步驗證HSA的這種類似酶催化的效應，又做了溫度變化實驗。圖四表明溫度變化對HSA催化FCLA化學反應存在影響。其中A圖表明隨著溫度的升高，FCLA分子和氧分子趨向更易發生反應，因此發光增強，但在溫度超過60℃時，可觀測到化學發光強度的下降。加了HSA的實驗顯示了同樣的結果，不同的是發光下降的溫度閾值被延后了。圖B顯示了HSA增強發光的比率變化，雖然從絕對值上在低于60℃時反應是隨著溫度的增加而增加的，但比率結果顯示在約20℃時HSA具有最高的相對催化反應效果。

3 討論

圖4 溫度對氧化產生化學發光的影響。A:化學發光強度與溫度的關系;B:化學發光比率與溫度的關系。將FCLA(10μmol/L)溶液和FCLA(10μmol/L)+HSA(10μmol/L)溶液 2mL 分別置入玻璃平皿，用電加熱器底部均勻加熱，并同時熱電偶溫度檢測儀測量溫度，同時用光子計數器計數Fig.4 A:The relation of chemiluminescence and temperature;B:The relation of chemiluminescence ratio and temperature.Temperature influences photons emitting.FCLA(10μmol/L)and FCLA(10μmol/L)+HSA(10μmol/L)solution(2mL)was transmitted into a glass vessel respectively.The vessel was evenly heated.The temperature and emitting photons were detected simultaneously

等溫滴定實驗結果表明FCLA和HSA是一個吸熱的結合過程。同時由△H ＞0，△S＞0及熱容等數據進一步分析表明:疏水作用是兩者結合的主要作用力。因此判斷結合位點在HSA的疏水腔中。當高溫破壞蛋白三級結構后，疏水腔消失，結合位點被破壞，對FCLA的發光增強作用消失。其原因可推測為:有活性的HSA三級結構完整，具有正常的藥物結合功能區，因此能夠和FCLA結合，而結合降低了氧化反應所需的活化能，進而促進了反應提高了化學發光的強度，而失活的HSA因為其三級結構的破壞，不但不能結合FCLA，反而由于大量裸露的還原性基團能夠對活性氧產生猝滅反應，形成和FCLA的氧化競爭，因此抑制了化學發光。總之，結合是提高氧化反應的關鍵，類似于酶的催化，HSA在反應過程中起到了催化的作用，HSA和FCLA的結合降低了FCLA分子氧化反應所需的活化能，促進了反應的進行。

酶的催化對溫度的依賴性很高，過高和過低的溫度都會影響酶的催化效率。為了研究HSA對FCLA氧化反應類酶催化效果，又考察了溫度對HSA催化作用的影響。實驗結果表明隨著溫度的升高，分子的動能增加，FCLA分子和氧分子趨向更易發生反應，因此發光逐漸增強。但過高的溫度(圖中約為60℃以上)也同時導致FCLA激發態分子自身的碰撞加劇，從而導致物理猝滅的發生。但是加了HSA后，由于FCLA和大分子HSA的結合降低了FCLA分子碰撞的幾率，因而可以在一定程度上抑制這種物理猝滅，使發光下降的溫度閾值延后。HSA增強發光的比率變化表明在20℃左右時HSA具有最強的相對催化效果。另外，結果顯示，HSA溫度影響曲線也和真正的酶有所區別，對溫度的敏感性沒有酶那么強，這也是和HSA在體內的功能并非催化生化反應作用有關。

總之，實驗結果表明，FCLA可以自發和HAS結合，通過HSA以類似酶作用的效果降低了FCLA分子氧化反應的活化能，導致了FCLA氧化反應的增強。利用結合物FCLA本身是化學發光探針，并借助單光子監測手段，我們實時高靈敏地觀測到了這種影響。血液中的HSA是許多藥物的載體，本研究表明，在設計和應用藥物時，HSA和藥物的結合輸運可能會導致藥物抗氧化或者抗藥物交叉反應能力的降低，一些藥物潛在的不良反應可能和這個原因有關。因此應該考慮避免這種結合導致的藥物副作用，以提高藥物的利用效率，防止副效應的產生。本研究對于提高藥物的壽命和藥效的發揮、降低藥物不良反應，進行科學的藥物分子設計等具有重要的指導意義。

［1］SUBRAMANIAN G M，FISCELLA M，LAMOUSé-SMITH A，et al.Albinterferon alpha-2b:a genetic fusion protein for the treatment of chronic hepatitis［J］.C Nat Biotechnol，2007，25(12):1411-1419.

［2］MEYER M C，GUTTMAN D E.The binding of drugs by plasma proteins［J］.J Pharm Sci，1968;57:895-918.

［3］ULRICH KRAGH-HANSEN，VICTOR TUAN GIAM CHUANG，MASAKI OTAGIRI.Practical aspects of the Ligand-Binding and enzymatic properties of human serum albumin Biol［J］.Pharm Bull，2002，25(6)695-704.

［4］KRAGH HANSEN U.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin［J］.Pharmacol Rev，1981，33:17-53.

［5］DOCKAL M，CARTER D C，RUKER F.Conformational transitions of the three recombinant domains of human serum albumin depending on pH［J］.J Biol Chem，2000，275:3042-3050.

［6］DOCKAL M，CARTER D C，RüKER F.The three recombinant domains of human serum albumin structural characterization and ligand binding properties［J］.J Biol Chem，1999;274:29303-29310.

［7］COLMENAREJO G.In silico prediction of drug2 binding strengths to human serum albumin［J］.Med Res Rev，2003，23:275-301.

［8］HE XIAOMIN，CARTER D C.Atomic structure and chemistry of human serum albumin［J］.Nature，1992，358(16):209.

［9］郭賓，李川.藥物與血漿蛋白結合的藥理學基礎及其研究進展［J］.中國臨床藥理學與治療學，2005，10(3)，241-253.GUO BIN，LI CHUAN.Progress in research and evaluation on drug2plasma protein binding in pharmacology［J］.Chin J Clin Pharmacol Ther，2005，10(3)，241-253.

［10］JING ZHOU，DA XING，QUN CHEN.Enhancement of fluoresceinyl cypridina luciferin analog chemiluminescence by HSA for singlet oxygen detection［J］.Photochemistry and Photobiology，2006，82，4.1058-1064.

［11］Y C WEI，J ZHOU，D XING，et al.In vivo monitoring of singlet oxygen using delayed chemiluminescence during photodynamic therapy［J］.J Biomed Opt，2007，12(1)，014002.

［12］SUZANN M，FARIAL A T，DING D Y，et al.Biacore in structure-function relationships and thermodynamics［J］.J Mol Biol，2000，300:321-337.

［13］AMIT A，CHANDRAMOULI B，NITI K，et al.Binding of berberine to human telomeric quadruplex-spectroscopic，calorimetric and molecular modeling studies［J］.FEBS J，2008，275:3971-3983.