阿托伐他汀通過激活PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導而促進神經(jīng)元突起生長

屈文慧，郁盛雪，隋海娟，金迎新，金向楠，金 英

(遼寧醫(yī)學院1.藥理學教研室，2.2008級臨床醫(yī)學專業(yè)本科，遼寧錦州 121001)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)患者記憶力下降的主要原因被認為是海馬和皮質(zhì)神經(jīng)突觸的丟失和神經(jīng)突起的功能障礙。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3 kinase，PI3K)具有類脂激酶和蛋白激酶的雙重活性，普遍存在于機體各類細胞中，可受多種細胞因子和理化因素激活，研究表明，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路在神經(jīng)元突觸極性的形成與穩(wěn)定中起關(guān)鍵性作用[1]。有報道PI3K參與了神經(jīng)細胞發(fā)育、分化、分級、生長、存活、細胞骨架重組、調(diào)節(jié)分泌和受體運輸?shù)榷喾矫嫔砉δ躘2]。目前大量實驗證明，PI3K阻斷劑抑制樹突早期發(fā)育和生長[3－7]。蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)，為逆轉(zhuǎn)錄病毒Akt-8的癌基因產(chǎn)物，故又稱Akt，激活后能介導多種生物學效應，是控制細胞生長的主要調(diào)節(jié)因子[8]。有研究報道Akt/哺乳動物西羅莫司(sibrolimus，雷帕霉素)靶蛋白(mammalian target of Rapamycin，mTOR)信號轉(zhuǎn)導通路主要調(diào)節(jié)樹突分支的形狀和程度，特別是調(diào)節(jié)樹突樹的發(fā)育[9]，及神經(jīng)元胞體大小[10]。核糖體 S6激酶(ribosomal S6-kinase，p70S6K)和真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4E-BP1)是mTOR下游兩個重要的靶蛋白，它們分別啟動蛋白質(zhì)的翻譯和促進蛋白質(zhì)的合成，繼而對細胞生長和代謝進行調(diào)控[11]。

阿托伐他汀(atorvastatin，Ato)屬于他汀類藥物，因其具有半衰期長、代謝好和強效安全的調(diào)脂作用而廣泛用于臨床。Ato為腦外藥物，必須經(jīng)過一系列的信號級聯(lián)反應才能引起細胞內(nèi)的相應改變。應用MEK阻斷劑PD98059(50 μmol·L－1)阻斷Ato對神經(jīng)元突起生長的促進作用并不明顯，從而推測Ato促進神經(jīng)元突起發(fā)育作用可能與激動MEK/ERK信號轉(zhuǎn)導通路有一定關(guān)系。前期研究發(fā)現(xiàn)，Ato對培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長有促進作用，本實驗探究Ato是否通過PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路影響神經(jīng)元突起發(fā)育。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

Ato，批號23922105，純度＞98%，購自 LKT Laboratories，Inc.公司，用二甲亞砜(DMSO)溶解。DMEM、F12、DMSO、胰蛋白(1∶250)和多聚賴氨酸，均購自Sigma公司;PD98059、LY294002和西羅莫司，購自碧云天生物技術(shù)研究所;新生胎牛血清、馬血清和HEPES，購自北京華美轉(zhuǎn)導科技有限公司;阿糖胞苷，購自意大利SPA公司;mTOR Substrates Antibody Sampler Kit和Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit，購自 Cell Signaling公司;曲西立濱、兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase，NSE)多克隆抗體、鼠抗神經(jīng)絲蛋白(neurofilament，NF200)單克隆抗體和山羊抗兔和山羊抗鼠二抗，均購自Santa Cruz公司;β肌動蛋白抗體，購自Beyotime試劑公司;SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物，購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)

出生24 h以內(nèi)的Sprague-Dawley大鼠乳鼠，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007，遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供。乳鼠75%乙醇浸泡消毒，無菌條件下取出大腦皮質(zhì)，置于培養(yǎng)基中，剔除血管和軟腦膜，剪成1 mm3左右的小塊。加入0.125%胰蛋白酶37℃消化10 min。待細胞分散后，加入含10%胎牛血清和10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。200目篩網(wǎng)過濾，1000×g離心10 min，用含10%胎牛血清和 10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×108～1 ×109L－1，接種在鋪有 L-多聚賴氨酸24孔或6孔培養(yǎng)板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后加入含阿糖胞苷(終濃度為5 mg·L－1)的培養(yǎng)基，抑制非神經(jīng)細胞增殖。以后每2 d換液1次，培養(yǎng)6 d后用于實驗。應用抗NSE多克隆抗體和NF200抗體免疫熒光染色進行神經(jīng)元純度鑒定，結(jié)果表明神經(jīng)元純度在90%以上。

1.3 實驗分組及處理

細胞分為正常對照組，加入等量培養(yǎng)基;Ato組，培養(yǎng)4 d 神經(jīng)元加入 Ato 10 μmol·L－1作用48 h;阻斷劑+Ato組，培養(yǎng)4 d神經(jīng)元分別加入MEK阻斷劑 PD9805950 μmol·L－1、PI3K 阻斷劑 LY29400230 μmol·L－1、Akt阻斷劑曲西立濱 2.5 μmol·L－1和mTOR阻斷劑西羅莫司100 nmol·L－1作用1 h，再加入 Ato 10 μmol·L－1共同作用 48 h。本實驗各阻斷劑的使用濃度根據(jù)有關(guān)文獻[12]報道和預實驗結(jié)果確定。

1.4 神經(jīng)元樹突形態(tài)學觀察分析

應用倒置相差顯微鏡，將每個神經(jīng)元拍攝到一個視野中。采用Tsview軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)樣本來自3個不同批次培養(yǎng)的神經(jīng)元，每批次隨機選取40～50個細胞。

1.5 Western印跡法檢測磷酸化磷酸肌醇依賴激酶1、磷酸化 Akt、磷酸化 mTOR、磷酸化 p70S6K和磷酸化4E-BP1蛋白表達水平

原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元，經(jīng)各種藥物處理不同時間后，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量。用10%～12%SDS-PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉。將膜放入一抗中(1∶1000)，4℃過夜。TTBS沖洗后，將膜放入二抗(1∶1000)中，室溫孵育1～2 h，TTBS洗膜后將膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余試劑，放置化學發(fā)光凝膠系統(tǒng)分析儀中進行Ecl化學發(fā)光。測定磷酸肌醇依賴激酶 1(phosphoinositide-dependent kinase-1，p-PDK1)，p-Akt(Ser473)，p-mTOR，p-p70S6K和p-4E-BP1。利用Visionworks 6.3.3圖像采集及分析軟件對蛋白帶進行分析。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1 阿托伐他汀對培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元突起發(fā)育的影響

倒置相差顯微鏡結(jié)果(圖1)顯示，Ato 10 μmo·lL－1可明顯促進神經(jīng)元突起生長，表現(xiàn)為突起分支總長度明顯增加、一級突起數(shù)目明顯增多、末端分支數(shù)明顯增多及胞體面積增大(圖1B1和圖2)。PI3K阻斷劑 LY29400230 μmol·L－1可明顯阻斷 Ato 對神經(jīng)元突起生長的促進作用(圖1B2和圖2)，說明Ato的這種作用與PI3K通路有關(guān)。PI3K下游激酶Akt阻斷劑 TCBN 2.5 μmol·L－1也能完全阻斷 Ato這種作用(圖1-B3和圖2)，說明與PI3K和Akt通路有關(guān)。Ato這種作用也能被mTOR阻斷劑西羅莫司 100 nmol·L－1所阻斷(圖 1-B4 和圖 2)，說明了Ato可能主要是通過PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路促進突起發(fā)育。單獨應用TCBN 2.5 μmol·L－1對神經(jīng)元突起生長也有抑制作用。

2.2 阿托伐他汀對皮質(zhì)神經(jīng)元p-PDK1和p-Akt蛋白表達水平的影響

Fig.2 Effect of Ato on dendritic complexity in cultured cortical neurons.See Fig.1 for the legend.TDBL:total dendritic branch length.Con:control;LY:LY29402;TCBN:triciribine.±s，n=30.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control group;#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Ato alone group.

Fig.3 Effect of Ato on phosphorylated phosphoinositide-dependent kinase-1(p-PDK1)in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:normal control;lane 2:Ato 10 μmo·lL－1;lane 3:LY294002+Ato;lane 4:LY294002.±s，n=3.＊＊ P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato 10 μmol·L －1group.

與正常對照組相比，Ato 10 μmol·L－1組可明顯增加神經(jīng)元 p-PDK1(圖3)和 p-Akt(Ser473)(圖4)的蛋白表達水平。LY294002可明顯抑制Ato引起的p-PDK1和p-Akt(Ser473)的蛋白表達水平增加。單獨應用LY294002能使神經(jīng)元p-Akt(Ser473)蛋白表達水平降低。但未能使p-PDK1蛋白表達水平降低達到統(tǒng)計學意義。

2.3 阿托伐他汀對皮質(zhì)神經(jīng)元p-mTOR蛋白表達水平的影響

與正常對照組相比，Ato 10 μmol·L－1組可明顯增加神經(jīng)元p-PDK1和p-Akt(Ser473)的蛋白表達水平。TCBN可明顯抑制Ato引起的p-mTOR的蛋白表達水平增加。單獨應用TCBN能使神經(jīng)元p-mTOR蛋白表達水平明顯降低(圖5)。

Fig.4 Effect of Ato on p-Akt protein levels in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:normal control;lane 2:Ato 10 μmol·L －1;lane 3:LY294002+Ato;lane 4:LY294002.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato alone group.

2.4 阿托伐他汀對皮質(zhì)神經(jīng)元 p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表達水平的影響

與正常對照組相比，Ato 10 μmol·L－1組可明顯增加神經(jīng)元 p-p70S6K(圖6A1，B1)和 p-4E-BP1(圖6A2，B2)的蛋白表達水平。西羅莫司可明顯抑制Ato引起的p-p70S6K和p-4E-BP1的蛋白表達水平增加。單獨應用西羅莫司能使神經(jīng)元p-4E-BP1蛋白表達水平降低。但未能使p-p70S6K蛋白表達水平降低達到統(tǒng)計學意義。

Fig.5 Effect of Ato on phosphorylated mammalian target of rapamycin(p-mTOR)protein levels in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:control;lane 2:Ato 10 μmol·L －1;lane 3:tricirbine+Ato;lane 4:tricirbine.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato group.

Fig.6 Effect of Ato on phosphorylated ribosomal S6-kinase(p-p70S6K，A)and phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1(p-4E-BP1，B)levels in cultured rat cortical neurons by Western blotting.See Fig.1 for the legend.A2 and B2 were the semiquantitative results of A1 and B1，respectively.Lane 1:normal control;lane 2:Ato 10 μmol·L －1;lane 3:sirolimus+Ato;lane 4:sirolimus.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group;##P＜0.01，compared with Ato alone group.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，Ato促進神經(jīng)元突起發(fā)育的作用與已發(fā)現(xiàn)的PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路有關(guān)，首先Ato可明顯促進神經(jīng)元突起生長，表現(xiàn)為突起分支總長度明顯增加、一級突起數(shù)目明顯增多、末端分支數(shù)明顯增多及胞體面積增大。應用PI3K阻斷劑LY294002可明顯阻斷Ato對神經(jīng)元突起生長的促進作用，說明Ato的這種作用與PI3K通路有關(guān)。PI3K下游激酶Akt阻斷劑曲西立濱也能完全阻斷Ato這種作用，說明與PI3K/Akt通路有關(guān)。Ato這種作用也能被mTOR阻斷劑西羅莫司所阻斷，推測Ato可能主要是通過PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路促進突起發(fā)育。此外，應用PI3K阻斷劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路，再加入Ato，Ato可以對抗LY294002所致的PI3K下游蛋白p-PDK1和p-Akt473表達的減少，應用西羅莫司阻斷Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路，同樣Ato可以對抗西羅莫司所致的Akt下游蛋白p-mTOR表達的減少，Ato這種作用也能被mTOR阻斷劑西羅莫司所阻斷，西羅莫司可明顯阻斷Ato引起的p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白表達水平增加。因此，該結(jié)果也能進一步支持我們的推測。

PI3K/Akt/mTOR這個經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導通路，可被數(shù)個跨膜受體和配體結(jié)合所產(chǎn)生的細胞信號所激活，如胰島素樣生長因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、血小板源性生長因子和某些藥物等[13－15]，通過與其受體結(jié)合激活細胞內(nèi)的突變胰島素受體酶解物[16]，激活PI3K，活化后的PI3K磷酸化細胞膜上的磷脂酰肌醇生成PIP2和PIP3，生成的磷脂產(chǎn)物通過結(jié)合蛋白的PH結(jié)構(gòu)域，使PDK1和Akt都被結(jié)合到膜上，PDK1進一步激活Akt(Thr308)。Akt是PI3K信號轉(zhuǎn)導通路中一個重要的下游靶激酶，活化的Akt可以直接磷酸化mTOR，哺乳動物mTOR是Akt信號轉(zhuǎn)導通路中一個重要的下游靶激酶，通過多種途徑調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和生長。活化后的Akt蛋白再轉(zhuǎn)位到胞漿中或胞核內(nèi)，通過對一系列底物的磷酸化，使其下游的mTOR被激活，活化的mTOR通過磷酸化激活下游兩個重要的靶蛋白。p70S6K和4E-BP1是mTOR下游兩個重要的靶蛋白，它們分別啟動蛋白質(zhì)的翻譯和促進蛋白質(zhì)的合成，繼而對細胞生長和代謝進行調(diào)控[11]，本研究結(jié)果顯示，Ato能對抗通路PI3K/Akt/mTOR下游相關(guān)蛋白質(zhì)的減少，從而促進神經(jīng)元突起發(fā)育。

為進一步闡明阿托伐他汀在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用提供了新的實驗依據(jù)，同時也為他汀類藥物開拓出新的廣闊治療方向。

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