白藜蘆醇通過上調(diào)小鼠胚胎干細胞過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活子1α表達促進其分化為心肌細胞

方海琴，趙 君，崔亞雄，袁海濤，楊 嶸，榮 靖，趙增明，何 俊，彭雙清

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制研究所毒理學(xué)評價研究中心，北京 100071;2.國家食品安全風(fēng)險評估中心衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點實驗室，北京 100021)

胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESC)是一類源于囊胚時期內(nèi)細胞團的特定細胞群，具有分化為體內(nèi)3個胚層來源的各種類型組織細胞的潛能。近年來，ESC定向誘導(dǎo)分化為心肌細胞研究成為國內(nèi)外研究人員共同關(guān)注的熱點之一，獲得足量、均一、高純度、不引起免疫排斥反應(yīng)且具有再生能力的心肌細胞為心臟疾病的治療帶來了新的希望。動物實驗證實，ESC源的心肌細胞能代替缺失或受損的心肌細胞以恢復(fù)和改善心臟功能[1－2]。

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠ESC能夠通過懸浮培養(yǎng)形成胚體(embryonicbody，EB)，這些EB可進一步分化為心肌細胞，通過光學(xué)顯微鏡即可觀察到這些由ESC分化而來的心肌細胞的自發(fā)性收縮。進一步研究顯示，這一體外分化過程再現(xiàn)了心臟發(fā)生和心肌收縮發(fā)育的過程[3]。基于化合物對ESC的細胞毒性與對ESC分化為心肌細胞的抑制能力的測試，2001年歐洲替代方法驗證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)接受并批準(zhǔn)小鼠ESC實驗(embryonic stem cell test，EST)用于化合物胚胎發(fā)育毒性評價，ECVAM的EST操作流程也成為目前ESC分化為心肌細胞的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[4－5]。但此操作規(guī)程是在ESC細胞自發(fā)分化的基礎(chǔ)上制訂，并未探討如何獲得足量、均一、高純度的心肌細胞。因此，按照EST的操作規(guī)程，ESC自發(fā)向心肌細胞分化的效率并不高，且ESC細胞分化為心肌細胞是一個漸進和復(fù)雜的過程，目前對于ESC誘導(dǎo)分化準(zhǔn)確的調(diào)控機制尚不清楚。為了提高 ESC 的心肌分化效率，人們紛紛采用改變分化培養(yǎng)條件，在不同時間點添加不同藥物等方法，但只有準(zhǔn)確掌握其誘導(dǎo)分化的機制，才有可能在分子水平上精確誘導(dǎo)ESC分化為所需的心肌細胞，消除一些不利因素[6]。

有研究表明，線粒體的生物合成對ESC向心肌細胞分化起正向促進作用[7－8]。線粒體生物合成是指在一個細胞的生命周期中線粒體的增殖，以及線粒體的系統(tǒng)合成和個體合成過程。在未分化ESC中線粒體的數(shù)目以及嵴都較貧乏，而分化的ESC發(fā)生急劇變化，表現(xiàn)為嵴豐富，數(shù)目增加，形成網(wǎng)絡(luò)化[9－10]。過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)共激活子1α(PPARγ coactivator 1α，PGC－1α)是線粒體生物合成的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。

白黎蘆醇是一類含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，主要存在于葡萄、百合科、寥科、豆科、花生和虎杖等食用或藥用植物，具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗癌、抗氧化和抗血小板聚集等作用。另外，白藜蘆醇可降低血循環(huán)中的低密度脂蛋白和膽固醇，增加心肌細胞功能，其對冠心病顯著的預(yù)防與治療作用引起人們關(guān)注[12]，且白藜蘆醇對PPARγ有激活作用[13]。本研究將針對白藜蘆醇是否在ESC分化為心肌細胞中所起到的干預(yù)作用與分子調(diào)節(jié)機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器

小鼠ESC D3細胞購自中國科學(xué)院上海生物細胞研究所。白藜蘆醇購自上海融禾公司(純度＞95%)。knockout－DMEM 培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium)、高糖DMEM、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，β－巰基乙醇、非必需氨基酸(NEAA)、N－2－羥乙基哌嗪－N－2－乙磺酸(HEPES)、L－谷氨酰胺，青鏈霉素雙抗和 Trizol均購自德國Invitrogen Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲亞砜(DMSO)和明膠購自德國Sigma公司。小鼠白血病抑制因子(murine leukemia inhibitory factor，mLIF)購自美國 CHEMICON公司。PPARγ、PGC－1α、α 肌動蛋白和 GAPDH 一抗購自美國Abcam公司，HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗體)購自中杉金橋生物技術(shù)公司，RT－PCR試劑盒購自加拿大 Fermentas公司，SYBG試劑盒購自日本TaKaRa公司，引物(表1)α－肌球蛋白重鏈(α－myosin heavy chain，α－MHC)、PPARγ、PGC－1α、核呼吸因子－1(nuclear respiratory factor－1，NRF－1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子 A(mitochondrial transcription factorA，mtTFA)和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ(mitochondrial respiratory chaincomplexⅣ，COXⅣ)由北京賽百盛公司合成。Bio－Rad Real－Time PCR 儀(美國伯樂公司)，透射電鏡(日本Hitachi公司)。

Tab.1 Primer sequence and length of amplified fragments

1.2 細胞培養(yǎng)及白藜蘆醇給藥干預(yù)

自液氮中取出一支凍存的小鼠ESC，復(fù)蘇后接種于自制備用的小鼠胚胎成纖維細胞 (mouse embryonic fibroblast，MEF)滋養(yǎng)層，加入 ESC完全培養(yǎng)基 (15%FBS，84%knockout－DMEM，1%HEPES，1%NEAA ，1% 雙抗，0.1% β－巰基乙醇，mLIF 1×107U·L－1)維持培養(yǎng)。ESC集落達60%～70%融合時，進行傳代。0.25%胰酶(含EDTA)消化處于對數(shù)生長期的ESC，用差速貼壁的方法除去MEF滋養(yǎng)層細胞，培養(yǎng)基中不再添加mLIF。消化后的ESC單細胞懸液進行計數(shù)，取細胞3.75×104L－1懸滴培養(yǎng)于10 cm的細菌培養(yǎng)皿蓋板上，每滴20 μl，懸滴3 d后，倒置顯微鏡下可見每個懸滴中一個EB，將EB移入60 cm懸浮培養(yǎng)皿，加入10 ml無mLIF的ESC培養(yǎng)基(FBS 20%，其余成分同 ESC完全培養(yǎng)基)，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)2d后，將EB接種于事先鋪被1%明膠的24孔板內(nèi)。每孔內(nèi)一個EB，加入無mLIF的ESC分化培養(yǎng)基，輕搖使EB移至孔中央，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日倒置顯微鏡下觀察，1 d后可見EB外層細胞分化。

ESC形成EB貼壁后24 h，分別加入白藜蘆醇0.44，4.4 和 44 μmol·L－1培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

1.3 ESC分化為心肌細胞的相關(guān)指標(biāo)的檢測

EB貼壁培養(yǎng)5 d(白藜蘆醇干預(yù)96 h)后，光學(xué)顯微鏡下觀察24孔板內(nèi)EB自發(fā)分化為有自發(fā)收縮能力的心肌細胞的發(fā)生率，取分化后的細胞進行實時PCR和Western印跡實驗，檢測心肌特異性基因α－MHC和心肌細胞標(biāo)志性蛋白α輔肌動蛋白(α－actinin)的表達。

1.4 透射電子顯微鏡觀察分化ESC內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)

用細胞刮刀將正常對照組和白藜蘆醇4.4 μmo·lL－1組細胞刮下，200×g離心5 min，將細胞迅速放入裝有預(yù)冷固定液(2%多聚甲醛和2.5%戊二醛)的尖頭EP管中固定，二甲砷酸鈉緩沖液0.1 mo·lL－1沖洗后，再采用1%鋨酸(OsO4)固定2 h。細胞固定后進行乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹脂包埋，切片，切片厚度為50～80 nm。樣品干燥后，置于銅網(wǎng)上，采用 Philips EM208s型透射電子顯微鏡觀察，攝片。每組細胞采用3張切片，先在低倍鏡下進行全面細致的觀察，然后6000倍放大倍數(shù)下定量拍照。在選定的每張切片上隨機拍攝細胞內(nèi)照片各5張。

1.5 實時熒光定量 PCR 法測定 α－MHC，NRF－1，mtTFA和COXⅣ基因表達

用細胞鏟刮取每組24個EB，每組加入1 ml Trizol，冰浴超聲破碎，按Trizol試劑盒說明書要求提取胚胎中總RNA。260 nm紫外吸收法檢測RNA含量。各組取1 μl RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以 cDNA進行擴增反應(yīng)，加入 α－MHC，PGC－1α，PPARγ，NRF－1，mtTFA 和 COXⅣ等基因的上下游引物各10 pmol，反應(yīng)體系總體積25 μl。反應(yīng)條件設(shè)置為:預(yù)變性95℃ 1 min;95℃/30 s，58℃/15 s，72℃/15 s，共 40個循環(huán)。以 GAPDH為內(nèi)參，進行半定量分析。目的基因的相對表達水平 用 2－ΔΔCt表 示，ΔCt=Ct目標(biāo)基因－ CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt藥物組－ΔCt對照組。

1.6 Western印跡法測定分化 ESC內(nèi) PPARγ、PGC－1α和α輔肌動蛋白表達

白藜蘆醇干預(yù)96 h后，各組取1～2塊24孔板內(nèi)分化培養(yǎng)的ESC，RIPA法提取細胞蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度確定合適的上樣量。蛋白電泳完畢后，采用濕法將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印至PVDF膜。根據(jù)預(yù)染蛋白標(biāo)記剪取目的蛋白條帶，PPAR γ、PGC－1α、α 輔肌動蛋白及 GAPDH 所用一抗的稀釋比例為1∶1000。一抗孵育完成后，用TBST洗膜，HRP標(biāo)記的二抗室溫溫育1 h;使用LumiGLO?Chemiluminescent Substrate(KPL)進行發(fā)光底物孵育，根據(jù)目的蛋白的不同，采用不同的曝光時間。使用Quantity ONE軟件對目的蛋白進行積分吸光度(integrated absorbance，IA)光密度分析，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。目的蛋白相對表達水平=IA目的蛋白/IAGAPDH。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對ESC分化為心肌細胞的影響

小鼠ESC在MEF上生長良好(圖1A)，消化傳代時，按懸滴懸浮法制備 EB并誘導(dǎo)分化(圖1B)，分化10 d的細胞外圍可見多種類型細胞，部分克隆可見心肌自發(fā)性節(jié)律收縮。

Fig.1 Differentiation of embryonic stem cells(ESC)to cardiomyocytes(original magnification ×200).A:arrows pointed undifferentiated murine ESC;B:arrow pointed differentiated murine ESC.

顯微鏡下計數(shù)觀察發(fā)生心肌細胞搏動的EB數(shù)量，結(jié)果顯示(表2)，在ESC分化第10天，與正常對照組相比，白藜蘆醇 0.44 與 4.4 μmol·L－1組自發(fā)搏動的EB數(shù)明顯增加(P＜0.05)。

Tab.2 Effect of resveratrol on numbers of EB containing contracting myocardial cells in 24－well plates

2.2 白藜蘆醇對分化的ESC內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示(圖2)，與正常對照組分化的 ESC 細胞相比(圖 2A)，白藜蘆醇 4.4 μmol·L－1干預(yù)96 h，其細胞內(nèi)線粒體更加豐富，結(jié)構(gòu)完整，提示白藜蘆醇可以上調(diào)ESC在細胞分化過程中的線粒體生成(圖2B)。

Fig.2 Effectofresveratrolon ultrastructure of mitochondria in differentiated ESCs(×6000).A:normal control group;B:resveratrol 4.4 μmol·L －1for 96 h group.Arrows pointed mitochondria in the differentiated murine ESC.

2.3 白藜蘆醇對分化的ESC內(nèi)α－MHC，PPARγ，PGC－1α，NRF－1，mtTFA和COXⅣ基因表達的影響

如圖3 所示，白藜蘆醇0.44，4.4 與44 μmol·L－1培養(yǎng)96 h后，與正常對照組ESC相比，各組ESC內(nèi)心肌細胞特異基因α－MHC表達顯著增加，分別為466%，271%和59%;PGC－1α基因表達分別增加了163%，321%和28%，PGC－1α基因表達分別增加了405%，530%和165%，NRF－1基因表達分別增加了270%，159%和72%，mtTFA的基因表達分別增加了45%，125%和17%，線粒體生成的標(biāo)志因子COXⅣ基因表達分別增加 52%，266%和22%。除 44 μmol·L－1組的 mtTFA 和 COXⅣ基因表達外，其他差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of resveratrol on mRNA expression of α－MHC，PPARγ，PGC－1α，NRF－1，mtTFA and COXⅣ in differentiated murine ESCs.Differentiated ESC were treated with resveratrol 0，0.44，4.4 and 44 μmol·L －1for 96 h.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal control group.

2.4 白藜蘆醇對分化的ESCα輔肌動蛋白、PPARγ和PGC－1α蛋白表達的影響

如圖4所示，與正常對照組ESC相比，白藜蘆醇干預(yù)96 h后，各劑量組心肌細胞標(biāo)志蛋白α輔肌動蛋白表達增加，分別增加了65%，101%和21%;PPARγ蛋白表達分別增加了 69%，176%和153%;PGC－1α蛋白表達分別增加了121%，149%和27%。除白藜蘆醇 44 μmol·L－1組的 α 輔肌動蛋白和PGC－1α蛋白表達外，其余差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

按照ECVAM推薦的ESC分化為心肌細胞的觀察指標(biāo)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在白藜蘆醇干預(yù)96 h后，有自發(fā)搏動的EB數(shù)較對照組明顯增加，提示白藜蘆醇可以促進ESC向心肌細胞的分化。但ESC分化為心肌細胞是一個漸進和復(fù)雜的過程，包括心肌特異基因的轉(zhuǎn)錄、結(jié)構(gòu)蛋白的表達以及離子通道的形成等關(guān)鍵步驟。心肌分化啟動首先是心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子與心肌特異性基因的表達，在整個心肌發(fā)育過程中心臟特異性基因α－MHC表達相對較早，肌小節(jié)蛋白的表達標(biāo)志心肌細胞分化到成熟階段[14－15]。

為了進一步明確白藜蘆醇是否有促進ESC向心肌細胞分化的作用，本研究挑選心肌細胞特異性基因α－MHC與心肌細胞標(biāo)識蛋白α輔肌動蛋白為分子標(biāo)志物，進一步對分化細胞中心肌細胞特異性成分進行半定量分析。α－MHC基因在ESC分化為心肌細胞的早期即有表達并持續(xù)，而α輔肌動蛋白的表達則對應(yīng)著心肌細胞分化成熟階段[3]。通過對α－MHC進行實時 PCR以及α輔肌動蛋白進行Western印跡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以上調(diào)分化ESC中心肌細胞特定基因和標(biāo)志蛋白的表達，尤其在濃度 4.4 μmol·L－1時，白藜蘆醇的誘導(dǎo)作用最強，提示白藜蘆醇增強轉(zhuǎn)錄因子α－MHC的表達，繼而增強了α輔肌動蛋白表達，證實白藜蘆醇可以促進ESC向心肌細胞分化。

用透射電鏡觀察分化的ESC細胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇 4.4 μmol·L－1給藥 96 h，細胞內(nèi)線粒體數(shù)量更為豐富，嵴結(jié)構(gòu)完整，提示白藜蘆醇在促進ESC向心肌細胞分化的同時伴隨著線粒體生成的增加。

樓宜嘉等[16－17]在以淫羊藿誘導(dǎo)小鼠 ESC向心肌細胞分化的過程中，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)表達上調(diào)，激活 p38MAPK以及PGC－1α 和 PPARα。已有充分證據(jù)表明，PGC－1α是一個重要的線粒體生物合成調(diào)節(jié)子[11]，提示在ESC分化過程中，PGC－1α介導(dǎo)的線粒體生物合成可能在誘導(dǎo)ESC分化為心肌細胞中發(fā)揮作用。PGC－1α有助于協(xié)調(diào)有氧代謝相關(guān)基因的表達，且PGC－1α的表達受很多因素影響。業(yè)已明確，PGC－1α可以與大多數(shù)核激素受體包括PPARγ在內(nèi)的超家族成員，以不同的方式與其發(fā)生分子對接，進而調(diào)控其生物學(xué)功能[18]。

很多研究表明，白藜蘆醇對PPARγ受體起激動作用。葛恒等[13]在自身不表達 PPARγ蛋白的U937細胞中電穿孔共轉(zhuǎn)染PPARγ表達質(zhì)粒和其報告質(zhì)粒，從而構(gòu)建PPARγ激動劑篩選模型的方法證實，白藜蘆醇為PPARγ受體的激動劑。李曉寒等[19－20]證實，白藜蘆醇通過調(diào)節(jié) PPARγ 的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，防御高脂飲食大鼠血脂的升高，并拮抗心肌組織PPARγmRNA的低表達，在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中起保護作用。本研究實時PCR實驗結(jié)果與Western印跡實驗結(jié)果顯示，白藜蘆醇上調(diào)了分化的ESC細胞內(nèi)PPARγ與PGC－1α的基因和蛋白表達。由此推測，白藜蘆醇激動PPARγ受體，同時上調(diào)了其輔因子PGC－1α的表達。

很多核基因編碼的線粒體酶類對PGC－1α產(chǎn)生應(yīng)答，例如NRF－1和NRF－2，它們觸發(fā)編碼呼吸鏈多肽及mtDNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制蛋白的核基因的表達。NRF－1和NRF－2是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，作用于編碼氧化磷酸化系統(tǒng)亞基組分的核基因的表達。同時，在核內(nèi)它們通過綁定氧化磷酸化基因啟動子的共有序列調(diào)節(jié)其他與mtDNA復(fù)制有關(guān)的基因的表達[21]。mtTFA 是一個轉(zhuǎn)錄因子，與 mtDNA D－loop區(qū)的啟動子作用，調(diào)節(jié)線粒體基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[22]。導(dǎo)致分化的ESC線粒體豐度和線粒體功能的變化依賴于線粒體及mtDNA的質(zhì)量。當(dāng)細胞具有優(yōu)質(zhì)的親本線粒體和mtDNA時，將導(dǎo)致線粒體豐度和mtDNA分子的增加，最終由于增加了線粒體而使能量供應(yīng)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)后，均不同程度地上調(diào)了上述信號因子的基因表達。

COXⅣ是由核編碼的線粒體蛋白，被認為是線粒體和核基因之間轉(zhuǎn)錄、翻譯及調(diào)節(jié)等作用的典型，能夠?qū)€粒體的生物合成給予最快速的應(yīng)答。因此，本研究選用COXⅣ作為線粒體生物合成的指標(biāo)。實時PCR結(jié)果顯示，白藜蘆醇在激活分化ESC內(nèi)線粒體生物合成的信號通路后，最終上調(diào)了COXⅣ基因的表達。結(jié)合線粒體的形態(tài)學(xué)指標(biāo)透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)白藜蘆醇4.4 μmol·L－1干預(yù)96 h，分化后的ESC細胞內(nèi)線粒體數(shù)量更為豐富，嵴結(jié)構(gòu)完整。至此，本研究初步證實了白藜蘆醇對ESC向心肌細胞分化的調(diào)控作用是通過上調(diào)線粒體生成發(fā)揮的。

線粒體生物合成增多說明由一種相對較低的活動狀態(tài)向較高的呼吸功能轉(zhuǎn)化，預(yù)示著胞內(nèi)較高的能量要求，在ESC分化過程中此變化類似于胚胎發(fā)育中的線粒體受到體內(nèi)環(huán)境的影響，線粒體的活性和分布狀況會隨著胚胎發(fā)育時期的不同而改變[23]。研究證實，ESC細胞向心肌細胞分化過程中，能量代謝和供應(yīng)方式從糖酵解向有氧代謝轉(zhuǎn)變，因此需要線粒體的數(shù)量與功能的增加來維持分化[9]。

綜上所述，白藜蘆醇激活PPARγ受體，進而上調(diào) PGC－1α 的表達，激活 NRF－1 和 mtTFA，使得ESC內(nèi)線粒體的生物合成增加，線粒體功能增強，線粒體數(shù)量與質(zhì)量的循環(huán)改善，進而為ESC分化為心肌細胞提供足夠的能量，以及良好地適應(yīng)分化過程中代謝方式轉(zhuǎn)變的需求，最終表現(xiàn)為促進ESC分化心肌細胞。

[1]Guan K，Rohwedel J，Wobus AM.Embryonic stem cell differentiation models:cardiogenesis，myogenesis，neurogenesis，epithelial and vascular smooth muscle cell differentiation in vitro[J].Cytotechnology，1999，30(1－3):211－226.

[2]Singla DK，Hacker TA，Ma L，Douglas PS，Sullivan R，Lyons GE，et al.Transplantation of embryonic stem cells into the infarcted mouse heart:formation of multiple cell types[J].J Mol Cell Cardiol，2006，40(1):195－200.

[3]Rolletschek A，Blyszczuk P，Wobus AM.Embryonic stem cell－derived cardiac， neuronal and pancreatic cells as model systems to study toxicological effects[J].Toxicol Lett，2004，149(1－3):361－369.

[4]Genschow E，Spielmann H，Scholz G，Seiler A，Brown N，Piersma A，et al.The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests:results of the definitive phase and evaluation of prediction models.European Centre for the Validation of Alternative Methods[J].Altern Lab Anim，2002，30(2):151－176.

[5]Riebeling C，Pirow R，Becker K，Buesen R，Eikel D，Kaltenh?user J，et al.The embryonic stem cell test as tool to assess structure－dependent teratogenicity:the case of valproic acid[J].Toxicol Sci，2011，120(2):360－370.

[6]Heng BC，Haider HKh，Sim EK，Cao T，Ng SC.Strategies for directing the differentiation of stem cells into the cardiomyogenic lineage in vitro[J].Cardiovasc Res，2004，62(1):34－42.

[7]St John JC，Ramalho－Santos J，Gray HL，Petrosko P，Rawe VY，Navara CS，et al.The expression of mitochondrial DNA transcription factors during early cardiomyocyte in vitro differentiation from human embryonic stem cells[J].Cloning Stem Cells，2005，7(3):141－153.

[8]Chung S，Dzeja PP，F(xiàn)austino RS，Perez－Terzic C，Behfar A，Terzic A.Mitochondrial oxidative metabolism is required for the cardiac differentiation of stem cells[J].Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2007，4(Suppl 1):S60－S67.

[9]Prigione A，Adjaye J.Modulation of mitochondrial biogenesis and bioenergetic metabolism upon in vitro and in vivo differentiation of human ES and iPS cells[J].Int J Dev Biol，2010，54(11－12):1729－1741.

[10]Mandal S，Lindgren AG，Srivastava AS，Clark AT，Banerjee U.Mitochondrial function controls proliferation and early differentiation potential of embryonic stem cells[J].Stem Cells，2011，29(3):486－495.

[11]Wu Z，Puigserver P，Andersson U，Zhang C，Adelmant G，Mootha V，et al.Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC－1[J].Cell，1999，98(1):115－124.

[12]Baur JA，Sinclair DA.Therapeutic potential of resveratrol:the in vivo evidence[J].Nat Rev Drug Discov，2006，5(6):493－506.

[13]Ge H，Zhang JF，Wang BY，Wang CQ.Agitation effect of resteratrol on PPAR－γ[J].Chin Pharm J(中國藥學(xué)雜志)，2005，40(12):905－908.

[14]Zaffran S，F(xiàn)rasch M.Early signals in cardiac development[J].Circ Res，2002，91(6):457－469.

[15]Lyons GE，Schiaffino S，Sassoon D，Barton P，Buckingham M.Developmental regulation of myosin gene expression in mouse cardiac muscle[J].J Cell Biol，1990，111(6 Pt 1):2427－2436.

[16]Ding L， Liang XG， Zhu DY， Lou YJ.Icariin promotes expression ofPGC－1alpha， PPARalpha， andNRF－1 during cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells in vitro[J].Acta Pharmacol Sin，2007，28(10):1541－1549.

[17]Fragomeni G，Merola A，De Franciscis S，Amato F.A haemodynamic model of the venous network of the lower limbs[J].Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc，2007，2007:1002－1005.

[18]Puigserver P， Spiegelman BM. Peroxisome proliferatoractivated receptor－gamma coactivator 1 alpha(PGC－1 alpha):transcriptional coactivator and metabolic regulator[J].Endocr Rev，2003，24(1):78－90.

[19]Li XH，Yin RL，Song M，Zhang D，Cheng NL，Tan XT.Effects of resveratrol on PPAR gamma mRNA expression in heart of hyperlipidemia rats[J].Acta Nutr Sin(營養(yǎng)學(xué)報)，2009 ，31(1):91－93.

[20]Li XH，Song M，Yin RL，Tan XT.Effects of resveratrol on PPARγ /AP－1 in heart of rats with high－fat diet[J].Chin J Public Health(中國公共衛(wèi)生)，2011，27(5):589－590.

[21]Evans MJ， Scarpulla RC. NRF－1:a trans－activator of nuclear－encoded respiratory genes in animal cells[J].Genes Dev，1990，4(6):1023－1034.

[22]Virbasius JV，Scarpulla RC.Activation of the human mitochondrial transcription factor A gene by nuclear respiratory factors:a potential regulatory link between nuclear and mitochondrial gene expression in organelle biogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(4):1309－1313.

[23]Van Blerkom J，Davis P，Alexander S.Differential mitochondrial distribution in human pronuclear embryos leads to disproportionate inheritance between blastomeres:relationship to microtubular organization，ATP content and competence[J].Hum Reprod，2000，15(12):2621－2633.