曲尼司特對糖尿病大鼠腎單核細胞趨化蛋白1表達的抑制作用

閆 睿，符麗娟，王 婧

(遼寧醫學院藥理學教研室，遼寧錦州 121001)

腎間質纖維化是各種原因引起的腎疾病進入慢性腎衰竭的共同途徑。糖尿病性腎病是引起終末期腎衰竭的主要原因之一，是糖尿病患者死亡的主要慢性并發癥之一。近年來，隨著對糖尿病的研究深入，如何防治其嚴重并發癥成為首要任務。糖尿病性腎病是由代謝紊亂引起的復雜性疾病，病理特征為早期腎小球肥大，進展至基底膜增厚及系膜擴張，腎小球細胞外基質(extracellular matrix，ECM)積聚、腎小球硬化及間質纖維化。近年研究發現炎性因子單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)參與ECM 的積聚，進而加重糖尿病性腎病進展。MCP-1是一種特異的趨化因子，有著很強的單核細胞趨化激活作用。研究發現，正常的腎組織可分泌微量的MCP-1，而當腎組織受到刺激后其MCP-1 mRNA及蛋白質表達明顯高于正常組織，并與腎損害程度成正相關[1]。而肥大細胞分化增殖活化，從分泌顆粒釋放細胞因子、化學趨化因子和生長因子等炎性介質。曲尼司特(tranilast)可以穩定肥大細胞和嗜堿性細胞的細胞膜，抑制過敏性物質的釋放。它的作用隨著時間的推移被逐漸挖掘，從最先的抗過敏，治療哮喘，到如今成為焦點的抗纖維化作用，其對皮膚和眼的纖維增殖性疾病的抗纖維化已被證實。但對腎間質纖維化的研究尚不明確。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，應用曲尼司特干預觀察MCP-1在糖尿病腎纖維化發生、發展中的作用，同時探討其對糖尿病腎纖維化的作用及機制，為尋求抗腎纖維化的靶點和延緩腎間質纖維化的方法和制劑提供理論與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，貨號:H1027S，美國Sigma公司。曲尼司特，批號:國藥準字H1093017-5，中國藥科大學制藥有限公司。MCP-1試劑盒，編號:SX01094，上海森雄科技實業有限公司。S-P9002免疫組化試劑盒購自北京中山金橋公司。堿性磷酸酶標記的山羊抗兔抗體和β肌動蛋白和NBT/BCIP顯色液購自碧云天試劑公司。三諾安穩血糖儀，長沙三諾生物有限公司。

1.2 動物、模型制備及分組

SD大鼠，40只，♂，體質量230～270 g，2月齡，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK(遼)2009-0007。適應性飼養 1周后，將40只大鼠隨機分為正常對照、模型、曲尼司特100和200 mg·kg－1組，每組10只。除正常對照組注射等容積 0.1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液外，其余各組一次性尾靜脈注射 STZ 30 mg·kg－1[2]，72 h后非同日連續3次測定血糖均≥16.7 mmol·L－1為造模成功大鼠。按照分組ig給予曲尼司特每天1次，連續12周，正常對照組和模型組ig給予等量生理鹽水。

1.3 腎指數測定、生化指標檢測及標本采集

給藥第12周末，用代謝籠準確收集24 h尿標本，記錄尿量測定24 h尿蛋白，禁食12 h后稱質量。檢測空腹血糖。ip給予20%烏拉坦(5 ml·kg－1)大鼠麻醉，頸總動脈取血2 ml，3000×g離心10 min，分離血清檢測BUN。處死大鼠，腎以冰生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后稱重，計算腎指數=右腎質量(mg)/體質量(g)×100，以冰生理鹽水沖洗干凈，左腎凍存于－80℃ 冰箱中備用，右腎以10%中性甲醛溶液固定，PBS洗，石蠟包埋 ，制成4 μm切片備用進行病理、免疫組化檢查。

1.4 Masson染色觀察腎組織病理變化

取腎組織，用10%甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，切片，Masson染色觀察腎臟膠原纖維增生情況。各組隨機選取5只大鼠，每只大鼠隨機取5張切片，每張切片在統一放大倍數下(×400)隨機選取10個視野，鏡下觀察腎組織病理形態學變化及測算膠原容積分數(CVF)，CVF(%)=膠原面積/總面積×100。

1.5 免疫組織化學法檢測腎組織MCP-1蛋白表達

取腎組織，常規石蠟包埋，切片厚2 μm脫蠟至水;含3%H2O2的甲醇室溫孵育25 min，阻斷內源性過氧化物酶;微波修復抗原;加入1∶100稀釋的兔抗鼠單克隆抗體(一抗)，置濕盒中4℃過夜;1∶100稀釋生物素化山羊抗兔 IgG(二抗)，37℃孵育25 min;DAB顯色:1 ml蒸餾水加入試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應時間5 min，陽性細胞于細胞質出現棕黃色顆粒;蘇木精輕度復染細胞核;脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.6 Western印跡法檢測腎組織MCP-1蛋白表達

取約100 mg腎組織，立即放入預冷的Tris緩沖液中〔TBS(mmol·L－1):1%Triton，0.1%SDS，0.5%去氧膽酸，EDTA 1，Tris 20(pH 7.4)，NaCl 150，NaF 10〕，4℃超聲粉碎后，12000 ×g 離心30 min，取上清，用Lowry等[3]法測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標準品，將蛋白濃度調成一致。用10%～12%SDS-PAGE分離蛋白質，每個泳道蛋白上樣量為20～50 μg。為了準確判斷目的蛋白帶的位置，一個泳道加Seeblue plus 2預染蛋白標志物。電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質電轉移至聚偏氟乙烯膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用 TBS〔Tris 10 mmol·L－1(pH 8.0)，NaCl 150 mmol·L－1〕洗膜 3 次，每次 10 min。將膜放入一抗中(所有一抗均1∶500稀釋)，4℃過夜。TBS沖洗后，將膜放入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗中(二抗均1∶500稀釋)，室溫孵育1～2 h，然后用TBS洗膜3次，每次10 min，NBT/BCIP顯色液中避光顯色，直至出現，終止反應。對MCP-1進行測定。測定β肌動蛋白，以保證蛋白上樣量的一致性。將蛋白印跡顯像圖掃描，利用凝膠自動分析成像軟件Chem Image 5500對蛋白帶進行積分吸光度值(integrated absorbance，IA)分析，以β肌動蛋白為參照，計算二者IA比值表示MCP-1的表達。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 曲尼司特對糖尿病大鼠一般情況、腎指數及生化指標的影響

糖尿病大鼠模型組大鼠造模成功后，開始出現明顯的多飲、多食、多尿，逐漸消瘦，精神萎靡，至實驗結束時死亡2只;模型組大鼠體質量增加緩慢，曲尼司特100 和200 mg·kg－1組大鼠增長較快(P＜0.05)，兩組之間體質量差異無統計學意義，但均較正常對照組體質量明顯減輕(P＜0.05)。實驗過程中，曲尼司特100 mg·kg－1組因灌胃窒息大鼠死亡1只。表1結果顯示，與正常對照組相比，模型組、曲尼司特100和200 mg·kg－1組血糖、24 h 尿蛋白、血 BUN 均明顯升高(P＜0.01);模型組、曲尼司特100 mg·kg－1組腎指數明顯升高(P＜0.05)，曲尼司特200 mg·kg－1組腎指數與正常對照組相比無統計學差異;與模型組比較，曲尼司特100和200 mg·kg－1能明顯降低糖尿病大鼠腎指數、24 h尿蛋白、血BUN(P＜0.01)，但曲尼司特治療后24 h尿蛋白、血BUN均未恢復至正常對照組水平(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of tranilast(Tra)on levels of fasting blood glucose(FBG)，body mass and kidney index，urinary protein(UP)，and blood urea nitrogen(BUN)of diabetic model rats

2.2 曲尼司特對糖尿病大鼠腎形態的影響

由圖1可見，Masson染色在正常對照組的膠原染色主要位于腎小球基底膜、Bowman囊、系膜區和腎小管周圍血管，膠原容積分數(3.50±0.52)%，腎小球毛細血管襻開放良好，未見腎小球節段硬化，腎小管上皮細胞排列整齊(圖1A);模型組可見腎間質內大量膠原纖維增生，間質膠原呈現藍染，間質纖維化呈灶狀分布，可見腎小球局灶性節段性硬化(圖1B)，膠原容積分數為(7.05±1.49)%;曲尼司特 100 和 200 mg·kg－1組腎小球輕度腫脹，腎小管上皮細胞變性，間質纖維增生(圖1C，D)，膠原容積分數分別為(5.72±1.28)%和(4.94±1.06)%。上述改變較模型組均有減輕，具有統計學差異(P＜0.05)，曲尼司特200 mg·kg－1組更為顯著(P＜0.01)，但都未恢復至正常對照組水平(P＜0.05)。

Fig.1 Effect of tranilast on pathological changes in renal tissue of diabetic rats(Masson staining，×400).See Tab.1 for the rat treatments.A:normal control group;B:model group;C:Tra 100 mg·kg－1;D:Tra 200 mg·kg－1.Arrows show the collagen fiber.

2.3 曲尼司特對糖尿病大鼠腎組織MCP-1表達影響

2.3.1 免疫組化結果

由圖2可見，正常對照組腎小球內皮細胞、系膜細胞，腎小管及間質無明顯染色，腎組織少量表達MCP-1(圖2A)。模型對照組腎組織著色廣泛、濃集，MCP-1表達擴大及增強(圖2B)。與模型組比較，曲尼司特100和200 mg·kg－1組腎小管上皮細胞有弱著色，MCP-1表達程度減輕(圖2C，D)，提示曲尼司特可以減少糖尿病性腎病大鼠腎組織內MCP-1的表達。

Fig.2 Effect of tranilast on expression of monocyte chemcoattractant protein-1(MCP-1)in the kidneys of diabetic rats(Immunohistochemistry × 400).See Tab.1 for rat treatments.A:normal group;B:model group;C and D:tranilast 100 and 200 mg·kg－1groups.Arrows show positive cells.

2.3.2 Western印跡結果

由圖3及其半定量結果可見，與正常對照組(0.264±0.012)相比，模型組腎組織 MCP-1 蛋白表達水平(0.675±0.059)顯著增加(n=3，P＜0.01)。與模型組相比，曲尼司特100和200 mg·kg－1組MCP-1蛋白表達水平明顯減弱(n=3，P＜0.05)，分別為0.511±0.040 和0.404±0.075，其中曲尼司特200 mg·kg－1作用更加明顯(n=3，P＜0.01)，但都未恢復至正常對照組水平(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of tranilast on expression of MCP-1 in the kidneys of diabetic model rats by Western blotting.See Tab.1 for rat treatments.Lane 1:control group;lane 2:model group;lane 3:Tra 100 mg·kg －1;lane 4:Tra 200 mg·kg －1.

3 討論

MCP-1是單核巨噬細胞的特異性趨化因子，可由體內多種細胞產生，包括內皮細胞、單核細胞、平滑肌細胞、系膜細胞和腎小管上皮細胞等。已有研究發現，正常腎組織多種細胞均能分泌微量MCP-1，當腎組織受到刺激后，其MCP-1 mRNA及蛋白質的表達明顯高于正常組織，并與腎損害程度成正相關。本實驗中病程12周時，糖尿病大鼠血糖、BUN和24 h UP水平明顯高于健康對照組，腎毛細血管基底膜增厚、結構模糊;足突破壞、融合消失;系膜基質增多、系膜細胞腫脹，表明此時糖尿病大鼠已有糖尿病性腎病的改變。糖尿病性腎病組MCP-1表達量明顯高于健康對照組，而曲尼司特干預組，腎功能以及腎臟病理改變有明顯改善，且MCP-1的表達量也明顯降低。胡長軍等[4]研究也提示糖尿病大鼠組MCP-1表達較正常大鼠顯著上調。Ha等[5]研究發現高血糖和高糖基化血紅蛋白可刺激系膜細胞MCP-1 mRNA及MCP-1表達加強。還有研究發現，db/db糖尿病大鼠模型持續高血糖、腎小球免疫復合物沉積能刺激腎產生MCP-1，導致腎進行性損傷[6]。Morii等[7]也發現 MCP-1 通過趨化單核巨噬細胞在腎小管間質聚集，介導腎間質炎癥、腎小管萎縮和間質纖維化而促進糖尿病性腎病的發展。上述研究提示MCP-1的過表達在糖尿病性腎病發生、發展中可能起到重要作用。其機制可能與以下因素有關:①腎疾病中MCP-1水平的升高能增強多種細胞因子和黏附分子的表達和合成，加重腎損害;②MCP-1能激活單核細胞中的溶酶體酶等炎癥介質的釋放，并可引發氧化應激，激活蛋白水解酶，增加氧自由基的生成，直接損傷腎臟血管內皮細胞[8－9]。

曲尼司特可穩定肥大細胞和嗜堿性粒細胞的細胞膜，抑制過敏性物質的釋放。Mifsud等[10]研究發現，糖尿病性腎病大鼠模型每天給予曲尼司特(400 mg·kg－1，從第8周到第16周)干預，不影響血壓和血糖，但可改善腎小管纖維化和萎縮，降低腎小球硬化和蛋白尿。本研究結果表明，曲尼司特干預12周，糖尿病大鼠腎組織病理改變減輕，說明其可以抑制糖尿病模型大鼠腎小球基底膜增厚、系膜基質增多及腎間質纖維增生。同時曲尼司特干預使大鼠BUN、腎指數和24 h UP水平明顯降低，提示曲尼司特對糖尿病大鼠腎臟具有保護作用。此外，曲尼司特治療后，糖尿病大鼠腎MCP-1表達明顯降低，提示曲尼司特可以通過降低MCP-1表達，延緩糖尿病腎病變，起到腎保護作用。劉雪梅等[11]在狼瘡腎炎、IgA腎病、慢性腎小球腎炎等多種類型的腎活檢標本研究觀察了肥大細胞的數量與腎間質損害程度的關系，發現腎間質損害程度不同的各組腎小球腎炎比較，肥大細胞數有統計學差異，且與間質纖維化及腎功能衰竭呈明顯正相關，說明肥大細胞與間質纖維化有密切關系。而曲尼司特為肥大細胞的細胞膜穩定劑，具體作用有待于進一步研究。

綜上所述，MCP-1的過表達在糖尿病性腎病發生、發展中起重要作用，曲尼司特可阻止肥大細胞脫顆粒釋放炎癥介質MCP-1，從而延緩腎間質纖維化的發展。

[1]Tesch GH.MCP-1/CCL2:a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy[J].Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(4):F697-F701.

[2]Thomas G，Ramwell PW.Streptozotocin:a nitric oxide carrying molecule and its effect on vasodilation[J].Eur J Pharmacol，1989，161(2-3):279-280.

[3]Lowry OH，Rosebrough NJ，Farr AL，Randall RJ.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].J Biol Chem，1951，193(1):265-275.

[4]Hu CJ，Lu WP，Wu QM，Zhao YF.Significance of monocyte chemotactic peptide-1 expression in diabetes in rats[J].Acta Univ Med Nanjing(Nat Sci)〔南京醫科大學學報(自然科學版)〕，2005，4:246-248.

[5]Ha H，Yu MR，Choi YJ，Kitamura M，Lee HB.Role of high glucose-induced nuclear factor-kappaB activation in monocyte chemoattractant protein-1 expression by mesangial cells[J].J Am Soc Nephrol，2002，13(4):894-902.

[6]Chow F，Ozols E，Nikolic-Paterson DJ，Atkins RC，Tesch GH.Macrophages in mouse type 2 diabetic nephropathy:correlation with diabetic state and progressive renal injury[J].Kidney Int，2004，65(1):116-128.

[7]Morii T，Fujita H，Narita T，Shimotomai T，Fujishima H，Yoshioka N，et al.Association of monocyte chemoattractant protein-1 with renal tubular damage in diabetic nephropathy[J].J Diabetes Complications，2003，17(1):11-15.

[8]Giunti S， Tesch GH， Pinach S，Burt DJ，Cooper ME，Cavallo-Perin P，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 has prosclerotic effects both in a mouse model of experimental diabetes and in vitro in human mesangial cells[J].Diabetologia，2008，51(1):198-207.

[9]Wada T，Furuichi K，Sakai N，Iwata Y，Kitagawa K，Ishida Y，et al.Gene therapy via blockade of monocyte chemoattractant protein-1 for renal fibrosis[J].J Am Soc Nephrol，2004，15(4):940-948.

[10]Mifsud S，Kelly DJ，Qi W，Zhang Y，Pollock CA，Wilkinson-Berka JL，et al.Intervention with tranilast attenuates renal pathology and albuminuria in advanced experimental diabetic nephropathy[J].Nephron Physiol，2003，95(4):83-91.

[11]Liu XM，Zhu ZH，Deng AG，Zhang C，Zhu HY.Relationship between mast cells and tubulointerstitial lesions in chronic glomerulonephritides[J].Chin J Nephrol(中華腎臟病雜志)，2003，19(5):286-291.