Toll樣受體4/NF-κB信號通路參與黃芪多糖對腫瘤壞死因子α誘導的乳大鼠心肌細胞肥大的抑制作用

梁靈君，王洪新，孫雪芳，喻曉春，魯美麗，顧潔瑩，何海洋

(1.遼寧醫(yī)學院藥物研究所心血管藥物研究重點實驗室，遼寧錦州 121001;2.中國中醫(yī)科學院實驗中心，北京 100700)

黃芪是一味藥用歷史悠久、臨床應用廣泛的傳統(tǒng)補益類中藥。黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是從中藥黃芪中分離提純的主要有效成分之一。APS具有抗應激、抗氧化、抗自由基和降血糖等藥理作用[1]，對體外異丙腎上腺素[2](isoprenaline，Iso)和脂多糖[3](lipopolysaccharide，LPS)誘導的心肌肥大有一定的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)介導的信號通路在心力衰竭、動脈粥樣硬化、心肌炎、心肌重構等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[4－5]。TLR4 活化可以上調 NF-κB 的表達，進而調控多種炎性因子、黏附因子等表達[6]。TLR4/NF-κB信號轉導通路的活化介導了眾多炎性因子的表達，并且這些炎性因子參與了心肌損傷的反應并且在心肌肥大、心肌細胞凋亡、心肌收縮功能代償?shù)倪^程中起到重要的作用[7－8]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導的心肌肥大中，NF-κB[9]和 TLR4 的表達增加[10]，然而 NF-κB 信號通路和 TLR4 是否參與APS對TNF-α誘導的心肌肥大的抑制，國內外尚未見報道。因此，本研究主要利用體外培養(yǎng)的模型，重點觀察APS對TNF-α誘導的心肌肥大和炎癥反應的影響，進一步研究APS抑制TNF-α誘導心肌肥大的信號轉導機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

APS購自陜西森弗生物技術有限公司(批號:HQ090312)，純度為98%;白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA 試劑盒和 TNF-α 均購自R＆D 公司;IκBα 阻斷劑 BAY11-7082，IκBα 一抗，p65一抗和考馬斯亮藍法蛋白含量測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所;鼠抗兔二抗，二甲亞砜(DMSO)、胰蛋白酶和低糖DMEM培養(yǎng)基均購自Sigma公司;小牛血清購自Thermo公司;RT-PCR試劑盒、引物、標志物購自大連寶生物公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 體外乳大鼠心肌細胞培養(yǎng)

出生1～3 d的SD大鼠乳鼠，♀♂兼用，由遼寧醫(yī)學院動物實驗中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003-0007。在無菌條件下開胸取出心臟，D-Hank液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，加入0.8 g·L－1胰蛋白酶消化，取消化完畢的細胞，加入體積分數(shù)為0.15的小牛血清、0.84的DMEM培養(yǎng)基及0.01的含雙抗液(100 kU·L－1青霉素，100 mg·L－1鏈霉素)的培養(yǎng)基，吹打均勻后，采用差速貼壁的方法獲得較純的心肌細胞，然后根據(jù)實驗所需要的密度接種，5%二氧化碳及95%氧氣的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞分組及處理

常規(guī)培養(yǎng)心肌細胞2 d后換液，為了避免血清成分對實驗結果的影響，更換為含體積分數(shù)為0.0004的小牛血清培養(yǎng)基。按照處理細胞共分為7組:正 常 對 照 組，TNF-α 50 μg·L－1組，BAY11-70825 μmol·L－1組，TNF-α +BAY11-7082組，TNF-α +APS 25，50 和100 mg·L－1組，加入藥物作用30 min后，再加TNF-α共同作用48 h之后進行各指標的測定。

1.4 考馬斯亮藍法[11]測定細胞的總蛋白含量

取“1.3”處理的各組細胞，用D-Hank溶液沖洗 3 遍，加 0.5 ml NaOH(0.3 mol·L－1)，置100℃，30 min，使細胞裂解。根據(jù)計數(shù)，每孔細胞數(shù)約為5×105個，采用考馬斯亮藍法測定細胞的總蛋白含量。

1.5 培養(yǎng)心肌細胞體積的測定

取“1.3”處理的各組細胞，PBS溶液快速沖洗長滿細胞的培養(yǎng)孔3次，每孔加入0.1 g·L－1的胰酶0.3 ml，放入37℃恒溫箱中孵育10 min，隨后每孔加入含 0.1 g·L－1血清的培養(yǎng)基 0.2 ml終止消化。收集細胞注入一細胞室內(該細胞室底部是一經(jīng)硅化的蓋玻片，防止心肌細胞貼壁)，在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察細胞，幾乎呈球形，每組隨機選取4個視野，每個視野測20個細胞，用計算機CIAS大恒細胞圖像分析系統(tǒng)測量單個細胞的直徑，然后用球的體積公式計算細胞的體積。

1.6 Western印跡法測定心肌細胞 IκBα和 p65蛋白表達

用細胞刮刀刮下“1.3”處理的各組細胞，用PBS沖洗下來，離心，棄上清，收集沉淀的細胞冷藏于 －80℃冰箱備用。測定指標時取出樣品加入100 μl RIPA裂解液，用超聲波破碎儀破碎細胞(冰上操作)，10 s/次，共3次，在冰上放置30 min后，4℃12000×g離心30 min，提取上清液。BCA法進行蛋白濃度測定，使上樣量相同條件下計算每組應吸取的樣品上清的體積，補以上樣緩沖液使總為80 μl，再加 100 μl溴酚藍染液煮沸 4 min。然后各取10 μl樣品以及蛋白質標準品點樣。變性SDS-聚丙烯酰胺凝膠90 V恒壓電泳，半干法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，封閉，洗膜，加入1∶600稀釋的兔抗大鼠 IκBα和p65一抗，4℃雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入 1∶1000稀釋的二抗，搖床上雜交1 h，然后取出用TBST沖洗3遍，每次5 min，然后加ECL顯色，上機檢測。以β肌動蛋白為內標，用目標條帶與內標條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)的比值的百分率表示p65和 IκBα的相對表達水平。

1.7 RT-PCR法檢測心肌細胞ANP和TLR4基因的表達

收集細胞加入Trizol試劑1 ml裂解，收集細胞裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，回收總RNA。以質量濃度為10 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計A260/A280鑒定RNA純度和濃度。取約1 μg總RNA，進行逆轉錄。逆轉錄條件:30℃10 min，42℃ 30 min 95℃ 5 min。ANP 引物:上游:GGGCTCCTTCTCCATCAC，下 游:CCCTCAGTTTGCTTTTCA(198 bp)。TLR4引物:上游:CTATCATCAGTGTATCGGTG，下游:CAGTCCTCATTCTGGCTC(186 bp)。內參 GAPDH的引物:上游:AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC，下游:GGAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC(550 bp)。PCR反應條件:94℃ 45 s，55℃ 50 s，72℃1 min 15 s。電泳結束后，置于凝膠成像系統(tǒng)進行觀察，用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件對RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶進行密度分析。用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件GENETOOLS對RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶進行吸光度分析，根據(jù)ANP，TLR4和GAPDH吸光度分析結果比值，計算得到ANP和TLR4的相對表達量。

1.8 ELISA法檢測細胞外液IL-1β含量

試劑盒平衡于室溫20～25℃待用，取出96孔反應板，分別加入50 μl標本(或對照液或標準品)于反應孔里，吸取10 μl IL-1β抗體至反應孔里，室溫下孵育1 h，吸出液體，洗板3次，加50 μl顯色液，室溫孵育15 min，每孔加入50 μl終止液。全自動酶標儀在450 nm波長讀取吸光度值，繪制標準曲線，根據(jù)各標本A450nm在標準曲線上查得相應的濃度。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 APS對TNF-α誘導的乳大鼠心肌細胞蛋白含量和細胞體積的影響

表1結果顯示，與正常對照組相比，TNF-α模型組心肌細胞總蛋白含量增加了52.8%，細胞體積增大了66.7%(P＜0.01)。與模型組相比，APS 25，50和100 mg·L－1組，細胞蛋白質含量分別減少了12.9%，20.6%和24.4%(P＜0.01)。細胞體積分別減小了 20.5%，24.7%和 30.1%(P＜0.01)。BAY11-7082對正常心肌細胞蛋白含量和體積無影響，但可抑制TNF-α誘導的肥大心肌細胞的蛋白含量和細胞體積，分別減少27.3%和30.3%(P＜0.01)。

Tab.1 Effect of Astragalus polysaccharide(APS)on cell size and protein content of cultured myocardial cells in neonatal rats induced by tumor necrosis factor-α(TNF-α)

2.2 APS對TNF-α誘導的乳大鼠心肌細胞IκBα和p65蛋白表達的影響

圖1和表2結果顯示，與正常對照組相比，TNF-α組p65蛋白表達明顯增加了50.5%(P＜0.01)，IκBα 表達明顯減少了43.1%(P＜0.01)。與模型組相比，APS 25，50 和100 mg·L－1組 p65 蛋白表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，IκBα蛋白表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，BAY11-7082對正常心肌細胞p65和IκBα蛋白表達無影響，對TNF-α誘導的肥大心肌細胞的p65蛋白表達減少了 51.5%(P＜0.05)，IκBα 蛋白表達增加了48.5%(P＜0.05)。

Fig.1 Effect of APS on inhibitor-κBα(IκBα)and p65 expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α by Western blotting.Lane 1:normal control group;lane 2:TNF-α 50 μg·L －1group;lane 3:BAY11-70825 μmol·L－1group;lane 4:TNF-α+BAY11-7082 group;lanes 5，6 and 7:TNF-α +APS 25，50 and 100 mg·L －1groups，respectively.

Tab.2 Effect of APS on IκBα and p65 expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α

2.3 APS對TNF-α誘導的乳大鼠心肌細胞ANP mRNA表達的影響

圖2和表3結果顯示，與正常對照組相比，TNF-α組ANP mRNA表達增多了60.3%(P＜0.01)。與模型組相比，APS 25，50 和100 mg·L－1組 ANP mRNA明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。BAY11-7082對正常心肌細胞ANP mRNA無影響，但可抑制TNF-α誘導的ANP mRNA表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明APS可以抑制TNF-α誘導心肌肥大ANP mRNA表達。

Fig.2 Effect of APS on atrial natriuretic peptide(ANP)mRNA expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α.M:marker.Lane 1:normal control group;lane 2:TNF-α 50 μg·L －1group;lane 3:BAY11-70825 μmol·L －1group;lane 4:TNF-α +BAY11-7082 group;lanes 5，6 and 7:TNF-α +APS 25，50 and 100 mg·L －1 groups，respectively.

Tab.3 Effect of APS on atrial ANP mRNA expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α

2.4 APS對TNF-α誘導的乳大鼠心肌細胞TLR4 mRNA表達的影響

圖3和表4結果顯示，與正常對照組相比，TNF-α組TLR4 mRNA表達增多了68.7%(P＜0.01)。與模型組相比，APS 50和 100 mg·L－1組 TLR4 mRNA明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，BAY11-7082對正常心肌細胞TLR4 mRNA表達無影響，對TNF-α誘導的肥大心肌細胞的TLR4 mRNA表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of APS on Toll-like receptor 4(TLR4)expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α.M:marker.Lane 1:normal control group;lane 2:TNF-α 50 μg·L －1group;lane 3:BAY11-70825 μmol·L －1 group;lane 4:TNF-α +BAY 11-7082 group;lanes 5，6 and 7:TNF-α +APS 25 ，50 and 100 mg·L－1groups，respectively.

Tab.4 Effect of APS on TLR4 expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α

2.5 APS對TNF-α誘導的乳大鼠心肌細胞外液IL-1β含量的影響

表5結果顯示，與正常對照組相比，TNF-α組細胞外液中IL-1β含量增加了59.0%(P＜0.01);與模型組相比，APS 50 和 100 μg·ml－1組細胞外液中IL-1β含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，BAY11-7082對正常細胞外液IL-1β表達無影響，對TNF-α誘導的肥大細胞外液IL-1β表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

Tab.5 Effect of APS on interleukin-1β(IL-1β)expression in cultured myocardial cells of neonatal rats induced by TNF-α

3 討論

心肌肥大是心臟對多種病理刺激產(chǎn)生的一種適應性反應，心肌肥大最終會因心臟功能失常導致心力衰竭，與心臟病的高死亡率密切相關[12]。雖然誘導心肌肥大的分子機制尚未完全明了，但最近研究顯示，無論在動物模型[13]還是離體心肌細胞水平[14]上，抑制 TLR4/NF-κB 信號途徑能有效抑制心肌肥大，提示TLR4/NF-κB信號通路是參與心肌肥大發(fā)生發(fā)展的一條重要的信號通路。

本研究發(fā)現(xiàn)，APS可以抑制 TNF-α誘導的心肌肥大，且其抑制作用與 IκBα特異性阻斷劑BAY11-7082相似。同時還發(fā)現(xiàn)，APS不僅對TNF-α誘導的心肌肥大有抑制作用，而且還對TNF-α引起的炎性因子的表達有抑制作用。ELISA的結果顯示，TNF-α能引起細胞外液中分泌的 IL-1β增多，APS能夠有效抑制IL-1β炎性因子的分泌，保護心肌細胞。Western結果也顯示，APS可以抑制TNF-α引起的 p65表達增加和IκBα的降解，從而抑制 NF-κB信號通路的激活，且結果與 BAY11-7082效果相似，提示 NF-κB信號通路可能參與APS對TNF-α誘導的心肌肥大的抑制作用。

TNF-α是一種具有多種生物學效應的炎性細胞因子，調節(jié)多種不同的病理過程，如腫瘤惡病質、感染性休克、自身免疫性炎癥反應，也參與心血管疾病的發(fā)病[15]。TNF-α 的調控與 NF-κB[7]密切相關，細胞外刺激信號使體內 NF-κB活化，可以增強TNF-α的基因轉錄，促進后者的生存和表達;但是 TNF-α通過激活NF-κB信號通路，是否對TLR4的表達有影響，目前還沒有清楚的報道。Shyu等[16]的體外研究結果提示 NF-κB不僅介導TLR4的下游細胞轉導，而且可誘導TLR4的表達，所以TLR4和NF-κB之間也可能存在正反饋的調節(jié)。本實驗RT-PCR結果顯示，TNF-α能夠引起TLR4的表達明顯增加，表明TLR4和NF-κB之間可能真的存在正反饋的調節(jié)，但其具體具體機制尚不清楚，并且APS能夠有效抑制TLR4的表達。

綜上所述，APS可以抑制TNF-α誘導的心肌肥大，本研究對其機制進一步探索，發(fā)現(xiàn)APS可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活，從而抑制TNF-α誘導的心肌肥大，但TLR4/NF-κB信號通路具體屬何種機制抑制TNF-α的肥大效應尚需進一步研究。

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