橄欖葉提取物對實驗性兔關節軟骨損傷的修復作用

宮德正，耿成燕，姜麗平，王麗輝，吉村寬辛，仲來福

(大連醫科大學1.機能學實驗室，2.中日合作醫藥科學研究所，3.病理學教研室，遼寧大連 116044，4.Eisai Food ＆ Chemical Co.，Ltd.，Nihonbashi，Chuo-ku，Tokyo103-0027，Japan)

齊敦果(Olea earopaea)屬木科(oleaceae)，常綠闊葉喬木，又名洋橄欖或油橄欖。歐洲原產，我國引種，多栽培于長江以南。橄欖葉提取物(olive leaves extract，OLE)是從橄欖葉中提取的天然酚類物質，具有非常強的抗氧化[1]和抗動脈粥樣硬化[2]作用，并可預防癌癥[3]。據報道，橄欖葉具有降血壓和抗微生物等作用[4]。有文獻報道，榨橄欖時所產生的橄欖汁能明顯降低脂多糖處理BALB/c小鼠血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)水平，也能明顯降低脂多糖處理人單核細胞THP-1細胞TNF-α的分泌，認為橄欖汁可能是一種治療炎癥的有效成分，如風濕性關節炎和骨關節炎[5]。OLE是否對關節軟骨損傷有修復作用目前國內外尚無文獻報道。本研究通過對兔左后膝關節軟骨手工鉆洞制備兔關節軟骨損傷模型，觀察OLE對關節軟骨損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑

OLE由日本Eisai食品與化學有限公司提供，實驗時用水溶解。其主要組成包括22%羥基酪醇，4%多酚，67%糖類，2%脂質，4%強熱殘留物和1%水。番紅O和阿爾辛藍購自Sigma公司。

1.2 實驗動物和分組

12只健康新西蘭白兔，16周齡，體質量2.00～2.55 kg，由大連醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(遼)2002-0002。用前檢疫1周，單籠飼養，隨機分為模型對照組和OLE治療組，每組6只，雌雄各半。將OLE用蒸餾水溶解，OLE治療組按照成年兔每天120 ml·kg－1飲水量自由飲水足量給予 OLE 500 mg·kg－1，連續 21 d;模型對照組給予等體積蒸餾水。動物室溫度保持在23～25℃，相對濕度50%～60%，每天 12 h光照。

1.3 動物模型制備

靜脈給予戊巴比妥鈉40 mg·kg－1給兔實施麻醉，在兔左后膝關節處剪毛，用0.05%氯己定和75%乙醇消毒。在靠近膝關節內側面，從股骨向脛骨結節方向做一個垂直的皮膚切口。切開關節囊，通過人工脫臼的方法，把髕骨推向前側面，充分暴露膝關節的軟骨。用手鉆在關節軟骨上打直徑3 mm、深4 mm的3個洞。1個在滑車嵴中間，另2個在股骨末梢的滑車槽上。然后用生理鹽水沖洗傷口和關節囊。關節囊用人工可吸收(3-0)縫合線縫合，同時皮下組織和皮膚用尼龍線(3-0)縫合。手術后1周內用聚維酮碘(聚乙烯吡咯烷酮碘)對傷口消毒，每天1次;用鹽酸土霉素10 mg·kg－1肌內注射抗感染，每天2次。

1.4 兔軟骨損傷部位的肉眼觀察

實驗期間，每天觀察兔腹瀉和飲食情況及皮毛顏色，每周測體質量1次。手術后3周，iv給予戊巴比妥鈉80 mg·kg－1，實施安樂死。打開膝關節后，用單盲法肉眼觀察3個損傷部位(洞)軟骨的愈合情況。手術洞愈合的程度進行如下評分:愈合＜50%，計為0分，50%～60%計為1分，60%～80%愈合計為2分，80%～100%愈合計為3分，然后計算總評分[6]。同時觀察關節囊里滑液量和混濁度。當關節滑液有以細胞為內容物增加時進行涂片染色和瓊脂培養。

1.5 兔關節軟骨組織病理學檢查

兔安樂死后，取手術側膝關節用10%甲醛固定，固定后切片，厚5 mm，用5%醋酸振搖1 d脫鈣，脫鈣后用中性5%硫化鈉浸泡1 d，然后進行石蠟包埋，切片，厚5 μm。HE染色進行組織學檢查。用單盲法光鏡下觀察3個損傷部位(洞)軟骨的再生情況。手術洞軟骨再生的程度進行如下評分:無軟骨缺失(損傷部位全部由再生軟骨填充)計為0分;局限性缺失計為1～2分;較大范圍軟骨缺失計為3分;全面的軟骨缺失計為4分，然后計算總評分[7]。

1.6 兔關節軟骨蛋白聚糖(proteoglycan，PG)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)合成的測定

同1.5方法取手術側膝關節，制備石蠟切片，用番紅O和阿爾辛藍染色。番紅O染色所形成的紅色代表PG，阿爾辛藍染色所形成的藍色代表GAG[8]。把用番紅O和阿爾辛藍染色關節軟骨損傷部位和正常無損傷部位的圖片通過彩色數碼相機輸入電腦并通過Image-pro plus 4.5(Media Cybernetics)把影像數字化。隨機選取6個區域，通過影像處理技術計算每個區域番紅O染色形成的紅色平均光密度和阿爾辛藍染色形成的藍色平均光密度，分別代表關節軟骨 PG和GAG的合成量[8]。

1.7 兔股二頭肌和股內側大收肌肌肉質量比率的測定

兔安樂死后，分別取出手術側和無手術側股二頭肌和股內側的大收肌，稱重。肌肉質量的比率(%)=手術側肌肉質量/無手術側肌肉質量 ×100%。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 橄欖葉提取物對兔身體狀況的影響

兩組兔在實驗期間體質量無差異(表1)，飲食正常，皮毛光亮，無腹瀉。兩組兔手術側膝關節關節囊內滑液清亮，滑液量無差異。表明OLE無毒性作用，兔無感染。

Tab.1 Effect of olive leaves extract(OLE)on body mass of rabbits with experimental cartilage injuries

2.2 橄欖葉提取物對兔軟骨損傷愈合的影響

人工制備兔左膝關節軟骨損傷，肉眼觀察結果表明，手術3周后，OLE治療組3個洞的愈合評分和總評分均明顯高于模型對照組(P＜0.05)(表2)，表明OLE能促進損傷關節軟骨的愈合。

2.3 橄欖葉提取物對兔軟骨損傷后軟骨再生的影響

組織病理學檢查結果表明，模型對照組軟骨損傷部位缺乏新生軟骨，并有毛細血管增生和纖維原細胞增殖，在大部分部位無新生的軟骨組織(圖1A)。OLE治療組損傷部位成熟軟骨組織和連接組織混合再生，或大量成熟的軟骨組織在損傷部位再生，再生的軟骨組織周圍被增殖的纖維軟骨細胞所環繞(圖1B)。在3個損傷部位(洞)均隨機選取6個區域并對軟骨損傷后軟骨再生情況進行組織學評分，模型對照組為 17.3±3.0，OLE 治療組為8.7±0.6，OLE治療組明顯低于模型對照組(P＜0.05)，表明OLE具有促進軟骨損傷后軟骨組織再生的作用。

Tab.2 Effect of OLE on healing degree of holes at operated sites of rabbits with experimental cartilage injuries

Fig.1 Effect of OLE on cartilage regeneration of rabbits with experimental cartilage injuries(HE ×200).See Tab.1 for rabbit treatment.A:model control;B:OLE 50 mg·kg －1.Arrows show regenerated cartilage tissue.

2.4 橄欖葉提取物對兔軟骨損傷后軟骨基質PG和GAG合成的影響

由圖2A，B和表3可見，OLE治療組軟骨損傷部位(黑色箭頭所指)番紅O染色的平均光密度比模型對照組高(P＜0.05);正常軟骨無損傷部位(綠色箭頭所指)番紅O染色的平均光密度與模型對照組比較無明顯變化。表明OLE能促進軟骨損傷修復部位軟骨基質中PG的合成。

由圖2C，D和表3可見，OLE治療組軟骨損傷部位(黃色箭頭所指)和正常軟骨無損傷部位(粉色箭頭所指)阿爾辛藍染色的平均光密度與模型對照組比較無顯著性差異。

Fig.2 Effect of OLE on cartilage matrix formation of rabbits with experimental cartilage injuries(×200).See Tab.1 for rabbit treatment.Green arrow:safranin O staining of normal cartilage area for PG;black arrow:safranin O staining of restored area for PG;yellow arrow:alcian blue staining of restored area for GAG;pink arrow:alcian blue staining of normal cartilage area for GAG.A and C:model group;B and D:OLE 50 mg·kg －1.A and B:safranin O staining;C and D:Alcian blue staining.

2.5 橄欖葉提取物對軟骨損傷后兔肌肉質量比率的影響

由表4可見，OLE治療組股內側大收肌質量比率與模型對照組比較無明顯變化;股二頭肌質量比率較模型對照組升高(P＜0.05)，提示OLE具有抗炎鎮痛作用，可維持膝關節運動功能，防止肌肉廢用性萎縮。

Tab.3 Effect of OLE on proteoglycan(PG)and glycosaminoglycan(GAG)synthesis in cartilage matrix formation of rabbits with experimental cartilage injuries

Tab.4 Effect of OLE on mass of lateral great and biceps femoris muscle of rabbits with experimental cartilage injuries

3 討論

本研究結果表明，通過自由飲水給予兔OLE 500 mg·kg－1，連續21 d，能明顯促進實驗性關節軟骨損傷的修復。實驗期間飲食情況正常，皮毛光亮，無腹瀉，兩組兔體質量無差異。表明該劑量對兔無毒副作用，該結果與文獻報道一致[9]。

肉眼觀察結果表明，OLE治療組軟骨損傷部位的愈合比模型對照組更為顯著。組織學檢查結果表明，OLE治療組在軟骨損傷部位不僅有大量再生的成熟軟骨組織，而且再生的軟骨組織周圍環繞大量增殖的未分化的軟骨胚胎細胞。模型對照組在軟骨損傷部位幾乎看不見再生的軟骨，僅有大量再生的纖維組織。表明OLE具有促進軟骨損傷修復的作用。

正常關節軟骨由軟骨基質和鑲嵌在軟骨基質陷窩內的軟骨細胞組成，軟骨細胞只占1%，軟骨基質占99%。軟骨的基質由膠原纖維、PG和水構成，其中膠原纖維占20%～25%，PG占5%～10%，水占70%～75%。PG主要由GAG和蛋白組成，PG鑲嵌于膠原纖維網狀結構中，形成了水合性極強的黏稠膠體，使軟骨堅硬而富有彈性[10]。隨著年齡的增長或者軟骨遭到破壞時，軟骨細胞不能有效合成PG，最終導致關節損傷和骨性關節炎[11]。為了探討OLE對關節軟骨損傷修復的可能機制，本研究應用番紅O染色在軟骨組織切片上對PG進行半定量分析，以反映軟骨基質的變化，發現OLE治療組關節軟骨損傷修復部位軟骨基質中PG與模型對照組比較明顯增加，正常無軟骨損傷部位軟骨基質中PG與模型對照組比較無明顯變化。表明OLE能明顯促進軟骨損傷修復部位軟骨基質中PG的合成。用阿爾辛藍染色結果表明，OLE治療組軟骨損傷修復部位GAG合成與模型對照組比較無明顯變化，可能與GAG參與PG的合成有關。

本研究集體已研究報道，OLE具有抗炎和鎮痛作用，其作用機制可能與抑制TNF-α和白細胞介素1 mRNA的表達有關[12]。本研究結果表明，OLE可預防肌肉萎縮，考慮與其抗炎鎮痛作用和增加PG合成有關。股內側大收肌和股二頭肌與肢體運動相關。大收肌司職膝關節的伸展運動，膝關節伸展為了減輕疼痛。股二頭肌司職膝關節彎曲運動。當膝關節彎曲時，髕骨強烈壓在關節滑車上，可引起劇烈疼痛導致股二頭肌廢用性萎縮，關節軟骨損傷恢復被延遲。OLE可能具有抗炎鎮痛作用，避免因膝關節彎曲引起劇痛導致股二頭肌廢用性萎縮，間接促進軟骨損傷的修復。

綜上所述，OLE能夠促進人工關節軟骨損傷的修復并增加關節軟骨基質中PG的合成。OLE對關節軟骨損傷和骨性關節炎等疾病可能具有預防和治療作用。

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