OVCAR細胞轉染miR-130b下調多梳基因-1蛋白表達增加對卡鉑敏感性

林 琳，程曉東，傅真富

(1.浙江大學校醫院婦科，浙江杭州 310058;2.浙江大學醫學院附屬婦產科醫院，浙江杭州 310006;3.浙江省腫瘤醫院，浙江杭州 310022)

卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，其早期診斷比較困難，大約75%的患者診斷時已處于中晚期，所以化學治療是卵巢癌的主要手段，雖然近年來化療方案的不斷改進，但其5年生存率卻一直徘徊在25%～30%，原發性或繼發性耐藥是其化療成功的主要阻礙[1－2]。微小 RNA(microRNA，miRNA)是近年來發現的一類長17～25個核苷酸的內源性非編碼小RNA，其與靶點mRNA的非翻譯區域 (untranslated regions，3'UTR)區結合，誘導靶mRNA的降解或抑制翻譯[3]。miRNA是目前已知的最大一類調節基因，其在細胞的生長、增殖、分化、凋亡和個體的發育中發揮著重要作用，最近的研究表明，miRNA參與了許多癌癥的發生發展[4]，例如miR-21，miR-155，miR-373等發揮著癌基因的作用，而 miR-148a，let-7，miR-15a，miR-143，miR-34，miR-16等發揮著抑癌基因作用，并且最近已有 miRNA 用 于 治 療 惡 性 腫 瘤 的 報 道[5－6]。miR-130b是一個新發現的miRNA，已有研究顯示其通過調節抑癌基因RUNX3的活性抑制胃癌的發生[7]，并且在卵巢癌細胞中干擾miR-130b表達可以誘導細胞的耐藥[8]。

多梳基因-1(Bmi-1)為多梳組基因(polycomb group genes，PcG)家族成員之一，是近年來新發現的一個癌基因，參與鼻咽癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌等多種人類腫瘤的發生和發展，Bmi-1主要是下調細胞周期的抑制基因p16和p19表達，加速細胞G1/S期的過渡，從而導致細胞惡性克隆性增生[9－10]。

本研究觀察了卵巢癌OVCAR細胞轉染miR-130b基因片段后卡鉑對其敏感性的改變，并探討了轉染miR-130b基因片段對Bmi-1蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

卵巢癌OVCAR細胞購于美國ATCC細胞庫。青霉素、鏈霉素、四甲基偶氮唑藍(MTT)和卡鉑為美國Sigma公司產品，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，Lipofectiamine 2000購自廣州英韋創津公司，Trizol購自分子探針公司，逆轉錄試劑盒購自大連寶生物公司，miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京普博辛生物科技有限公司，miR-130b和內參U6引物、miR-130b模擬物以及陰性對照由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，Bmi-1、GAPDH抗體和HRP標記的兔抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。7100熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品。

1.2 細胞培養

人卵巢癌上皮OVCAR細胞培養于含10%胎牛血清、青霉素 100 kU·L－1及鏈霉素 100 kU·L－1的RPMI 1640培養液中，培養條件為37℃，5%CO2。

1.3 細胞RNA轉染實驗

OVCAR細胞接種于6孔板，細胞達到70%～80% 融合時，按照Lipofectiamine 2000轉染試劑盒說明書進行基因轉染實驗。化學合成的miR-130b模擬物:5'-UCAAUUUGCAUUUCGAAGUUU-3'，陰性對照為:5'-UUCGUCAUACGGCCUUAUACU-3';48 h后收集細胞提取總RNA，進行干擾效果的鑒定和相應的實驗。

1.4 細胞總RNA的提取及RT-PCR

收集細胞，每5×105～1×106個細胞加入1 ml Trizol，按照Trizol說明書操作，提取細胞總 RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄出cDNA第一鏈，用于后續的熒光定量PCR檢測。

1.5 熒光定量PCR擴增檢測miR-130b的表達

按照試劑盒說明書加入Q-PCR混合物、引物，置入7100熒光定量PCR儀反應。miR-130b正義引物:5'-CTCGGCAGTCAGGCGT-3'，反義引物:5'-GTCTCCGTCGCTTTCAGACGAT-3';內參照U6正義引物:5'-CTCGTTCGGCAGCACA-3'，反義引物:5'-AACGCTTCACAATGTGCGT-3'。擴增反應條件:94℃預變性15 s，95℃ 30 s，60℃ 15 s擴增40個循環，最后72℃延伸30 s。待測miRNA的表達量用2－△Ct表示，△Ct值=目的基因Ct值－內參基因 Ct值[5]。

1.6 MTT檢測細胞存活

將處于對數生長期的正常對照組、miR-130b模擬物轉染組和陰性對照組OVCAR細胞分別接種到96孔板，12 h后加入對倍系列稀釋的卡鉑(100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56 和 0.78 μmol·L－1)作用68 h。不同處理的 OVCAR細胞，加入 20 μl MTT 0.5 g·L－1孵育 4 h，100 μl DMSO 溶解結晶，酶標儀570 nm波長處測定吸光度(A)值，計算細胞存活抑制率(%)=(1－A用藥組/A對照組)×100%。每個濃度設3個復孔，實驗重復3次。參照肖建初等[11]的方法使用 Bliss法計算半數抑制濃度(IC50值)。

1.7 Western印跡法檢測多梳基因-1蛋白的表達

收集正常對照組、miR-130b模擬物轉染組和陰性對照組OVCAR細胞，PBS洗滌2次，1×SDS上樣緩沖液裂解細胞，95℃ 10 min，12000×g離心10 min，取上清，8%～12%SDS-PAGE 膠電泳2 h，電轉移蛋白至PVDF膜，將PVDF膜浸潤在含5%脫脂奶粉的TBST中1 h，加入特異性一抗4℃過夜，加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h，最后加入發光底物X線曝光顯示目的蛋白條帶。蛋白條帶使用美國Bio-Rad公司生產的QuantityOne軟件進行積分吸光度(IA)值分析，以目標蛋白與內標的IA比值表示蛋白的相對表達量。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 OVCAR細胞轉染miR-130b模擬物鑒定

熒光定量 PCR結果顯示，正常對照組、miR-130b模擬物轉染組和陰性對照組miR-130b表達的相對值分別為 0.22±0.08，0.46±0.12和0.23±0.10，miR-130b 模擬物轉染組miR-130b表達顯著高于正常對照組和陰性組(P＜0.01)，正常對照組和陰性組之間無統計學差異。說明轉染miR-130b模擬物的OVCAR細胞中miR-130b表達顯著增加，轉染成功。

2.2 轉染miR-130b模擬物對OVCAR細胞存活的影響

MTT實驗結果顯示(圖 1)，正常對照組、miR-130b模擬物轉染組和陰性對照組卡鉑對卵巢癌 OVCAR 細胞的 IC50值分別為 32.4±4.6，14.7±2.1和(31.4±4.2)μmo·lL－1，miR-130b模擬物轉染組顯著低于正常對照組和陰性對照組(P＜0.01)，說明上調miR-130b后可以顯著增加卡鉑對OVCAR細胞的敏感性，其敏感性約增加了2.21 倍。

2.3 轉染miR-130b模擬物對OVCAR細胞Bmi-1蛋白表達的影響

圖2結果顯示，正常對照組、miR-130b模擬物轉染組和陰性對照組Bmi-1蛋白條帶的IA值分別為0.75±0.16，0.21±0.12 和 0.77±0.18;與正常對照組相比，miR-130b模擬物轉染組Bmi-1蛋白的表達出現顯著降低(P＜0.01)，而陰性對照組 Bmi-1蛋白的表達則無顯著性改變。

Fig.1 Effectofmimic/miR-130b tranfection on OVCAR cell survival treated with carboplatin 0.78 －100 μ mol·L －1for 68 h by MTT assay.

Fig.2 Effect of miR-130b tranfection on expression of Bmi-1 by Western blotting.Lane 1:normal control cells;lane 2:mimic/miR-130b trasfected cells;lane 3:negative/miR-130b trasfected cells.

3 討論

miRNA模擬物是新近研發的一種可以刺激相應靶miRNA過表達的化學合成物，目前已廣泛用于miRNA的過表達研究，給miRNA的功能研究帶來了極大的方便[12]。本研究中熒光定量PCR結果顯示，所使用的miR-130b模擬物可以成功上調miR-130b的表達，在miR-130b高表達的狀態下，檢測了卡鉑對卵巢癌OVCAR細胞的敏感性，結果顯示，miR-130b高表達可以顯著增加卡鉑對OVCAR細胞的毒性。化療是卵巢癌的主要治療方法之一，但是化療藥物的細胞毒性和耐藥性則是成功化療的主要障礙。上述結果提示，化療時聯用miR-130b有可能減少卡鉑的用量或者克服卡鉑的耐藥。

進一步的研究顯示，miR-130b模擬物轉染組OVCAR細胞的Bmi-1蛋白出現了顯著的降低。已有研究顯示，Bmi-1在卵巢上皮性腫瘤中高表達，并且與淋巴結轉移及預后密切相關，是卵巢癌患者獨立的預后指標，并且細胞學實驗結果也顯示了基因沉默 Bmi-1后，可以顯著抑制卵巢癌細胞的生長[13－14]。由此推測，高表達的 miR-130b 可能是通過下調Bmi-1的表達增加了卡鉑對卵巢癌OVCAR細胞的敏感性，具體miR-130b調控Bmi-1的機制還有待進一步的研究來闡明。另外，本研究僅僅是在細胞水平完成的實驗，在體內能否可以達到相似的效果，還有待進一步的裸鼠移植瘤實驗來證實。

綜上所述，高表達miR-130b可以增加卡鉑對卵巢癌細胞的敏感性，下調Bmi-1蛋白表達可能是其增敏作用的主要機制，提示miR-130b有望成為克服卵巢癌鉑類耐藥的新靶點。

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