高表達受體活性修飾蛋白1對血管緊張素Ⅱ和降鈣素基因相關肽誘導的A10細胞降鈣素受體樣受體膜分布的影響

孫 飛，唐江瓊，鄭元斌，秦又發，陳臨溪，秦旭平

(1.南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001;2.成都軍區昆明總醫院藥劑科，云南昆明 650032)

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是辣椒素敏感性感覺神經末梢釋放的神經肽，在調節心血管功能方面發揮重要作用。前期研究證實，一定濃度的CGRP能抑制血清或血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導大鼠血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VMSC)的增殖[1－2]。CGRP功能發揮是通過其受體而實現的。CGRP受體是由降鈣素受體樣受體(calcitonin receptor-like receptor，CRLR)，受體活性修飾蛋白1(receptor activity modifying protein 1，RAMP 1)，受體組分蛋白(receptor component protein，RCP)3個組分組成。目前研究表明，對CGRP的應答作用主要是磷酸化CRLR的過程，而RAMP1的主要作用是糖基化CRLR和作為一種分子伴侶蛋白，將CRLR 轉運至胞 膜 上[3－4]。有 實 驗 證 實，增 加RAMP1表達可以加強VSMC對CGRP的應答作用[5－6]。本實驗觀察高表達 RAMP1 后，CGRP 對AngⅡ誘導的VSMC增殖及CRLR蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

大腸桿菌E.coli DH5α由南華大學生物化學教研室胡小波博士饋贈;pCDNA3.1/+質粒由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

CGRP，AngⅡ和 MTT，購自 Sigma公司;DMEM培養基和胎牛血清，購自Gibco公司;BCA Protein Assay Kit，購自 HyClone-PIERCE Biotechnology公司;RAMP1(兔多克隆抗體)、CRLR(山羊多克隆抗體)一抗及Western blotting Luminol Reagent，均購自Santa Cruz公司;β肌動蛋白一抗(兔多克隆抗體)及二抗(HRP-兔抗山羊和HRP-山羊抗兔)，購自博士德公司;無內毒素質粒小提試劑盒，購自百泰克;GenClean瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和DNA快速連接試劑盒，均購自上海捷瑞生物公司;LipofectamineTM2000轉染液和Trizol試劑，購自Invitrogen公司;EcoRI和BamHI內切酶、RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit，購自Fermentas LIFE SCIENCES公司;通用PCR試劑，購自上海生工生物工程有限公司;其他實驗所需試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

Mini PROTEANR 3 cell，美國;凝膠成像系統(Alphalmager TM 2200，美國)，Centrifuge5810/5810R型離心機，德國;IX70型熒光倒置顯微鏡，日本;TRANS-BLOTR SD SEMI-DRY TRANSFER CELL，美國;MyCyclerTM Thermal cycler，美國。

1.4 大鼠血管平滑肌細胞株A10細胞培養

A10購自ATCC。常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37℃ 5%CO2恒濕恒溫培養箱中培養。待細胞長滿后進行傳代培養用于實驗。

1.5 pCDNA3.1(+)-RAMP1 載體構建

從A10細胞中提取總RNA進行RT-PCR，獲取帶有酶切位點(EcoRⅠ和BamHⅠ)的RAMP1的開放閱讀框，再經過酶切、連接、轉化至 E.coli DH5α中，挑單克隆經初步鑒定后，送北京諾賽生物公司測序。

1.6 細胞轉染

將對數生長期的A10細胞消化接種于24孔板中，每孔1×105個細胞，待細胞長至80%融合時，換成完全培養基進行轉染。轉染前1 h用PBS洗2次，每孔加上500 μl opti-MEM培養基。按轉染試劑產品說明書提供的方法，用脂質體LipofectamineTM2000介導將帶有RAMP1的基因載體轉染入A10細胞，轉染4 h后換成10%FBS培養基，24 h后按1∶10比例進行傳代，再常規培養24 h后各組加入500 μl G418500 mg·L－1進行篩選，3 d更換1次篩選培養基。2周后可見克隆形成，將單克隆胰酶消化移至25 ml培養瓶中擴大培養(G418250 mg·L－1)，凍存細胞。

1.7 細胞分組處理

取生長良好的對數生長期的正常細胞(無質粒轉染)、僅轉染 pCDNA3.1(+)細胞〔pCDNA3.1(+)〕及轉染 pCDNA3.1(+)-RAMP1質粒的細胞〔pCDNA3.1(+)-RAMP1〕，PBS 洗2 次，胰蛋白酶消化后，用含10%FBS的DMEM制成細胞懸液，接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后，更換為含0.1%FBS的DMEM培養24 h使細胞同步化，按照分組，3種細胞分別用AngⅡ 100 nmol·L－1、CGRP 100 nmol·L－1和CGRP(預處理30 min)+AngⅡ處理24 h。

1.8 MTT法檢測A10細胞存活率

取1.7 處理的細胞，PBS 洗3 次，加20 μl MTT 5 g·L－1處理4 h 后，加 DMSO 振蕩10 min，用酶聯免疫儀在波長570 nm處讀取吸光度(absorbance，A)值，根據公式計算細胞存活率，存活率(%)=A處理組/A對照組×100%。

1.9 逆轉錄 PCR檢測RAMP1和CRLR mRNA水平

取1.7處理的細胞，提取細胞總RNA。細胞總RNA的提取按Trizol抽提試劑說明書進行。逆轉錄反應按RevertAidTMFirst Stand cDNA Synthesis Kit說明書進行。PCR 反應體系組成:9.5 μl ddH2O，12.5 μl 2 ×PCR Master，1 μl cDNA，上下游引物分別是:RAMP1為 5'-CGGGATCCACGGGGCTCTGCTTGCCATG-3'和5'-CCCGGAATTCCTACACGATGCCCTCTGTGCG-3';CRLR為5'-CAGCAGGAACCGAGTCAA-3'和5'-AGGCAGGAAGCAGAGGAA-3';β肌動蛋白為5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'和5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。取各引物 1 μl(10 μmol·L－1)，混勻后，短速離心，按以下條件進行反應:預變性94℃ 5 min，變性 94℃ 40s，退 火 40s(RAMP1:65℃，β肌動蛋白:62℃，CRLR:62℃)，延伸72℃ 40 s，進行30個循環，最后72℃延伸10 min。結束后，取產物5 μl，1.0%瓊脂糖凝膠電泳(80 V，40 min)，用灰度掃描目標條帶的積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內標IA比值的半定量法分析目的基因的表達變化。

1.10 Western印跡法檢測RAMP1和CRLR蛋白水的水平

取1.7處理的細胞，提取細胞總蛋白。用細胞裂解液裂解細胞，收集蛋白質，采用BCA法測定細胞蛋白質含量。蛋白質變性后每孔上樣65 g，經SDS-PAGE(RAMP1:12%;CRLR:10%，β肌動蛋白:10%)電泳后，10 V，400 mA半干式電轉至PVDF膜上(RAMP1:10 V，20 min;CRLR:10 V，40 min;β 肌動蛋白:10 V，25 min)。TBST(Tris·Cl 50 mmol·L－1，pH 7.6，NaCl 150 mmol·L－1，0.1%Tween 20)配制的5%脫脂牛奶室溫搖床封閉1 h，加入一抗(RAMP1效價為1∶100;CRLR 為1∶200;β 肌動蛋白為1∶1000)4℃孵育過夜，TBST洗膜4次(每次10 min)后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(效價為1∶1000)或兔抗山羊二抗(1∶1000)，室溫下搖床孵育2 h，TBST洗膜4次(每次15 min)，暗室中加發光劑A、B混液各200 μl于PVDF膜上激發熒光后壓片30 min后顯影、定影，洗片晾干后，用灰度掃描目標條帶與內標IA比值的半定量法來分析靶蛋白表達的變化。

1.11 免疫熒光檢測RAMP1和CRLR的膜分布

取1.7處理的細胞，PBS洗3次(5 min×3);4%多聚甲醛室溫固定30 min后，PBS洗3次(5 min×3);0.1%TritonX-100處理 10 min后，PBS洗3次(5 min×3);5%BSA封閉1 h后，加入一抗〔RAMP1(1 ∶30);CRLR(1∶60)〕4℃過夜，PBS洗3次(5 min×3)，避光加入熒光標記的熒光二抗〔FITC標記的驢抗兔IgG(1∶20);TRITC標記的驢抗山羊(1∶60)〕室溫下2 h后，PBS避光洗3次(5 min×3)。倒置熒光顯微鏡下觀察，RAMP1帶表現為綠色熒光，CRLR帶表現為紅色熒光。

1.12 統計學處理

2 結果

2.1 轉染RAMP1細胞的鑒定

圖1A結果顯示，pCDNA3.1(+)-RAMP1轉染組細胞中RAMP1 mRNA水平明顯高于無轉染的正常細胞和pCDNA3.1(+)轉染組細胞(P＜0.05)。圖1B 結果顯示，pCDNA3.1(+)-RAMP1組細胞中RAMP1蛋白水平高于正常細胞和pCDNA3.1(+)組(P＜0.05)。這表明用脂質體能成功地將RAMP1基因轉染于A10細胞并能正常表達。

Fig.1 Determination of receptor activity modifying protein 1(RAMP1)gene expression by RT-PCR(A)and protein expression by Western blotting(B)in A10 cells.A2 and B2 were the semiquantitative result of A1 and B1，respectively.Lane 1:normal cells;lane 2:pCDNA3.1(+)cells;lane 3:pCDNA3.1(+)-RAMP1 cells.±s，n=3.*P＜0.05，compared with normal cells;#P＜0.05，compared with pCDNA3.1(+)cells.

2.2 高表達RAMP1對CGRP抑制AngⅡ誘導的A10細胞存活的影響

圖2 結果顯示，轉染對3種細胞的存活率無影響。但單獨用CGRP、AngⅡ處理細胞或兩者合并則能顯著增加3組細胞的存活率(P＜0.05)。CGRP處理使pCDNA3.1(+)-RAMP1細胞存活率明顯高于其他兩組細胞，差異有統計學意義(P＜0.05)，提示高表達RAMP1能增加CGRP對靜止期細胞的增殖活性;AngⅡ能增加3組細胞的存活率，但組間無明顯差異，說明 RAMP1高表達對AngⅡ引起的細胞存活率無影響;高表達RAMP1用CGRP預處理細胞30 min，再加入AngⅡ培養作用24 h，細胞存活率明顯低于單純AngⅡ處理組(P＜0.05)，說明高表達RAMP1能增強CGRP抑制AngⅡ誘導的A10細胞增殖作用。

2.3 高表達RAMP1對CRLR表達的影響

圖3結果顯示，正常細胞、pCDNA3.1(+)細胞和 pCDNA3.1(+)-RAMP1細胞經 AngⅡ和(或)CGRP處理24 h后，CRLR mRNA水平無統計學意義(圖3A);無血清或AngⅡ對3種細胞的CRLR蛋白表達無差異，單獨使用CGRP處理使RAMP1高表達組細胞中CRLR蛋白表達增加(P＜0.05)，而 RAMP1高表達組細胞用 CGRP預先處理30 min再加入AngⅡ處理24 h后，細胞CRLR蛋白表達低于其他兩組(P＜0.05)(圖3B)。

Fig.2 Effect of RAMP1 overexpression on A10 proliferation by MTT.Three kinds of cells were treated with AngⅡ，CGRP or CGRP+AngⅡfor 24 h .±s，n=5.*P＜0.05 ，＊＊P＜0.01，compared with the cells of control group;#P＜0.05，compared with corresponding pCDNA3.1(+)cells with the same treatment;△P＜0.05，compared with the cells of AngⅡtreated group.

Fig.3 Effect of RAMP1 overexpression on expression of CRLR gene(A)and protein(B)in A10 cell by RT-PCR(A)and Western blotting(B).A2 and B2 were semiquantitative result of A1 and B1，respectively.a:normal cells;b:pcDNA3.1(+)transfected cells;c:pcDNA3.1(+)-RAMP1 cells.Lane 1:normal control group;lane 2:CGRP group;lane 3:AngⅡ group;lane 4:CGRP+AngⅡgroup.±s，n=3.*P＜0.05 ，＊＊P＜0.01，compared with normal control group;#P＜0.05 ，compared with pCDNA3.1(+)cells with the same treatment;△P＜0.05，compared with AngⅡ group.

2.4 高表達RAMP1對CRLR在細胞膜上分布的影響

免疫熒光檢測RAMP1和CRLR的膜分布結果(圖4)顯示，使用無血清或CGRP后，正常細胞和pCDNA3.1(+)細胞中的兩種蛋白主要分布于胞核周圍的胞漿區域(圖4A，B:a1～a3，b1～b3)，而高表達RAMP1組細胞中RAMP1與CRLR在膜上分布增加(圖4A，B:c1～c3);單獨使用AngⅡ或聯合使用CGRP和AngⅡ處理的3種細胞，其RAMP1和CRLR在膜上都有分布(圖4C，D)，且高表達組細胞中RAMP1與CRLR在膜上分布(圖4C，D:c1～c3)多于正常細胞和空載體轉染組細胞，說明細胞高表達RAMP1能促進CRLR向膜轉移。

3 討論

本實驗結果表明，高表達 RAMP1能增強CGRP抑制AngⅡ誘導的A10細胞增殖作用，其作用可能是通過增加CRLR的膜分布從而增強CGRP敏感性來實現。從本實驗可以看出，靜止期細胞無論是否高表達RAMP1，細胞的存活率均無改變，但給予CGRP和(或)AngⅡ均能促使細胞增殖(存活率增加)，AngⅡ對未轉染的正常細胞、pCDNA3.1(+)質粒轉染細胞或 pCDNA3.1(+)-RAMP1細胞的增殖作用最強，但3種細胞增殖率無差異;而在CGRP處理組細胞，高表達RAMP1組細胞的存活率卻顯著高于未轉染組和空載體組，這說明高表達RAMP1能增加對CGRP的應答作用。

Fig.4 Distribution of RAMP1 and CRLR on normal A10 cell membrane(a1 －a3)，pCDNA3.1(+)transfected cells(b1 －b3)and pCDNA3.1(+)-RAMP1 cells(c1 －c3).A:normal control group;B:CGRP treated group;C:AngⅡtreated group;D:CGRP+AngⅡtreated group.

目前已明確CGRP受體活化是由RAMP1和CRLR介導的。CRLR主要以3種形式存在:即50 ku，66 ku和110 ku。但是，本實驗只檢測到了CRLR的66 ku和50 ku形式，而并沒有檢測到110 ku的二聚體形式。本實驗結果顯示，無論是在正常細胞、pCDNA3.1(+)質粒轉染細胞或 pCDNA3.1(+)-RAMP1細胞，無論有無CGRP和(或)AngⅡ處理，各組細胞的中CRLR mRNA水平沒有變化，但是經CGRP和(或)AngⅡ處理的3種細胞CRLR(66 ku)的蛋白表達水平與未經CGRP或AngⅡ處理的細胞卻顯著增加，說明CGRP或AngⅡ能增加細胞CRLR的表達。但是CRLR蛋白之間的變化并不是因為高表達RAMP1所引起的，而可能是由于CGRP或AngⅡ引起細胞增殖導致的，這一推測已在其他研究中得到證實[7]。本實驗室前期結果也表明，RAMP1高表達可延長CGRP和AngⅡ誘導的VSMC的倍增時間[8]。對上述現象的解釋，Cueille等[9]認為可能與CRLR基因啟動子序列中的一個反式作用元件低氧誘導因子1α(hypoxiainducible factor-1 alpha，HIF-1α)表達增加有關，認為HIF-1α表達增加加強了CRLR的轉錄后調節，進而使CRLR蛋白表達水平升高，CRLR的啟動子序列中除了包含HIF-1α的順式作用元件外，還有Sp-1、Pit-1和糖皮質激素結合位點[10]。所以猜想該實驗結果很有可能是CGRP或AngⅡ增加了CRLR啟動子序列中某個調節元件的表達，從而加強了CRLR的轉錄后調節，使CRLR蛋白表達水平升高。另外，在本實驗中需要說明的是，在聯合使用CGRP和AngⅡ后，RAMP1高表達細胞的CRLR(66 ku)蛋白表達水平低于未轉染的正常細胞和空載體轉染細胞;而單獨使用CGRP處理后，高表達RAMP1細胞的CRLR(66 ku)蛋白表達水平高于未轉染組和空載體組;這表明在靜止期細胞，CGRP能通過增加CRLR的表達增加細胞的生存率，而在CGRP預處理細胞能抑制細胞的增殖，使單位體積細胞的數量減少，從而高表達 RAMP1細胞的CRLR(66 ku)蛋白總體水平降低，但這并不能說明單個細胞CRLR的表達降低。

本實驗的免疫熒光結果顯示，在無血清和CGRP處理因素的條件下，未轉染組和空載體組細胞中的RAMP1和CRLR大多分布于胞核周圍的胞漿區域，而高表達組中的這兩個蛋白在膜上的分布增加;單獨使用AngⅡ或聯合使用CGRP的3種細胞，其兩種蛋白都趨向于膜上分布，尤其在高表達組中，這種趨勢更加明顯。這一結果表明高表達RAMP1增強CGRP的抗增殖作用可能是通過增加CRLR膜分布，從而增強CGRP受體對CGRP的敏感性起作用。

RAMP1促進CRLR的膜分布的機制還不完全清楚。已證實，血管平滑肌細胞中存在CRLR和3種 RAMP[11]，即 RAMP1，RAMP2 和 RAMP3，3 種亞型之間與CRLR結合存在競爭。所以當RAMP1表達增加時，可能增加了RAMP1與CRLR結合的競爭力，加強了對CGRP的應答作用。除此之外，Héroux等[12]用雙分子熒光互補和化學發光共振能量轉移等技術證實:RAMP1和CRLR都能形成同源二聚體存在與內質網上。但是，只有當一分子的RAMP1與CRLR的同源二聚體形成異源三聚體時，才能被轉運至胞膜上。另外，RAMP1也存在同源二聚體形式，其功能不清。推測RAMP1·RAMP1在調節功能型CGRP受體形成方面起重要作用;其次，RAMP1同源二聚體主要分布于內質網中。研究發現內質網分泌蛋白，如VIP36和ERGIC-53，能以同源二聚體的形式轉運其他蛋白，RAMP1與這些分泌蛋白有著相同的膜拓撲結構[13－14]，提示同源二聚體RAMP1可能與轉運CRLR到細胞膜有關。總之，弄清RAMP1調節CGRP受體活化機制對發現心血管藥物的作用靶點有重要意義。

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