根除幽門螺旋桿菌四聯療法中奧美拉唑對比格犬鉍吸收的影響

郝瑞家，劉有平，梁 寧，曾文琴，楊雪明，邸 欣

(沈陽藥科大學1.藥物代謝與藥物動力學實驗室，2.環境化學教研室，遼寧沈陽 110016)

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，由質子泵抑制劑聯合兩種抗生素組成的三聯療法一直被推薦作為根除Hp的一線治療方案。但隨著抗生素在臨床上的廣泛使用，Hp耐藥菌株不斷增加，三聯療法對Hp的根除率明顯下降。研究表明，以質子泵抑制劑和鉍劑聯合兩種抗生素的四聯療法可顯著提高Hp的根除率，并在一定程度上克服Hp的原發耐藥和避免繼發耐藥的產生[1－6]。2005年由歐洲 Hp研究小組制定的MaastrichtⅢ共識報告中將質子泵抑制劑+鉍劑+甲硝唑+四環素的四聯療法推薦為根除Hp感染的一線替代方案[7]，2007年我國廬山共識報告中也將質子泵抑制劑合并鉍劑的四聯療法作為一線治療方案進行推薦[8]。值得注意的是，四聯療法中質子泵抑制劑和鉍劑雖都能有效抑制和殺滅Hp，但因鉍的作用機制和體內吸收依賴于胃內的酸環境，而質子泵抑制劑能抑制胃酸分泌，因此，二者合用時可能發生藥物間的相互作用。據文獻報道，鉍劑主要在局部發揮治療作用，吸收甚微，一旦過多的鉍進入生物體內，將會引起腎和中樞神經系統的毒性反應[9]。

本研究擬采用火焰原子吸收光譜法對比格犬口服膠體果膠鉍(bismuth，B)+甲硝唑(metronidazole，M)+四環素(tetracycline，T)(BMT)和奧美拉唑(omeprazole，Ome)+BMT(Ome+BMT)后鉍的藥代動力學進行比較，旨在探討根除Hp四聯療法中奧美拉唑對比格犬鉍吸收的影響，為四聯療法的臨床合理應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和儀器

健康比格犬，雌雄各半，體質量8～12 kg，由沈陽康平實驗動物研究所提供，動物合格證號:2009－0005。

膠體果膠鉍膠囊，規格:每粒鉍35 mg;甲硝唑片，規格:每片甲硝唑125 mg;鹽酸四環素片，規格:每片四環素125 mg和奧美拉唑腸溶膠囊，規格:每粒奧美拉唑20 mg，購自山西安特生物制藥股份有限公司。

高純金屬鉍，純度≥99.99%，由中國標準物質研究中心提供;鹽酸，優級純，購自沈陽經濟技術開發區試劑廠;硝酸，優級純，購自北京化工廠;高氯酸，優級純，天津市鑫源化工有限公司;純凈水，購自杭州娃哈哈集團有限公司;硼氫化鉀，分析純，購自中國醫藥集團上海化學試劑公司;氫氧化鈉，分析純，購自天津市大茂化學試劑廠。

WFX－120A型火焰原子吸收分光光度計，北京瑞利分析儀器公司;WHG－103A型流動注射氫化物發生器，北京浩天暉科貿有限公司;空心陰極鉍燈，北京真空電子技術研究所;WEA－3B型數顯精密加熱板，上海群尚儀器儀表有限公司。

1.2 給藥與生物樣本采集

結合臨床人用藥物劑量推算比格犬用藥劑量，參考所用藥物制劑規格最終確定每只比格犬總給藥量。采用雙周期隨機交叉試驗設計，將6只健康比格犬隨機分為2組，分別先后po給予膠體果膠鉍膠囊2粒(70 mg)+鹽酸四環素片2片(250 mg)+甲硝唑片2片(250 mg)或奧美拉唑腸溶膠囊2粒(40 mg)+膠體果膠鉍膠囊2粒(70 mg)+鹽酸四環素片2片(250 mg)+甲硝唑片2片(250 mg)。給藥前禁食12 h，分別于給藥前(0 h)和給藥后0.5，1，2，3，4，6，8，10，12 和14 h自犬前肢靜脈取血約3 ml，立即移入經肝素處理的離心試管中，2109×g離心10 min，分離血漿，于－20℃冰箱中保存，待測。

1.3 血漿樣品預處理

取比格犬血漿樣品500 μl，置于聚四氟乙烯坩堝中，加入消解液(硝酸∶高氯酸4∶1 ，V∶V)5 ml，加蓋靜置過夜，次日將坩堝置于沙浴電熱板上，加蓋加熱至120℃并維持0.5 h，然后再將溫度升高至180℃并維持2 h，開蓋待液體揮至近干，加純凈水1 ml，將酸揮盡，待液體再次近干后，加入20%鹽酸溶解殘留物并轉移至10 ml量瓶中，用20%鹽酸稀釋至刻度，搖勻，迅速轉移至塑料離心管中，待測。按相同的處理方法制備不含鉍的空白溶液。

1.4 建立火焰原子吸收光譜法測定血漿中鉍濃度

1.4.1 火焰原子吸收光譜法條件

采用火焰原子吸收光譜法測定比格犬血漿中鉍的濃度。采用高性能鉍燈，吸收線波長為223.1 nm，燈電流為3 mA，狹縫寬度為0.4 nm，電熱吸收管工作電壓為160 V，載氣流量為200 m·lmin－1，峰高讀數，積分時間為15 s。

1.4.2 標準曲線制備和定量下限的測定

取比格犬空白血漿500 μl，分別加入一系列不同濃度的鉍標準溶液，配制成相當于鉍血漿濃度為2.0，4.0，10.0，20.0，40.0 和 80.0 μg·L－1的血漿樣品，按1.3項下方法操作，每一濃度進行雙樣本分析。以待測物濃度為橫坐標(c)，待測物扣除空白的鉍吸收值為縱坐標(y)，用加權最小二乘法進行線性回歸運算。按上述方法配制鉍血漿濃度為2.0 mg·L－1的樣品，進行 6 樣本分析，計算精密度和準確度。

1.4.3 準確度和精密度的測定

取比格犬空白血漿500 μl，配制血漿濃度分別為4.0，20.0 和 70.0 μg·L－1的質量控制樣品，每一濃度進行6樣本分析，連續測定3 d。根據當日的標準曲線，計算質控樣品的測得濃度，并計算準確度和精密度。

1.4.4 鉍的穩定性考察

取空白血漿500 μl，配制鉍血漿濃度分別為4.0和70.0 μg·L－1的樣品，每一濃度進行 3 樣本分析，考察血漿樣品于－20℃放置60 d、經歷3次冷凍－解凍循環、室溫放置4 h以及血漿樣品經預后處理的血漿樣品室溫放置48 h的穩定性。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 火焰原子吸收光譜法測定鉍的方法學確證

2.1.1 鉍的標準曲線和定量限

鉍的標準曲線回歸方程為y=1.238×10－3c+1.314 ×10－3，鉍的線性范圍為2.0～80.0 μg·L－1。所建立的火焰原子吸收光譜法測定比格犬血漿中鉍的定量下限可達 2.0 μg·L－1。

2.1.2 鉍的準確度和精密度

鉍濃度為4.0，20.0 和 70.0 μg·L－1的質控樣品6樣本，經預處理后測定鉍的血藥濃度，并計算其精密度和準確度(表1)。

Tab.1 Accuracy and precision of bismuth in plasma of Beagle dog by flame atomic absorption spectrometry

2.1.3 鉍的穩定性

血漿樣品在經過－20℃放置60 d，3次冷凍－解凍循環，室溫放置4 h和處理后室溫放置48 h等處理后，測得鉍血藥濃度的RE均在±6.5%之間，提示鉍比較穩定。

上述結果表明，所建立的測定比格犬血漿中鉍分析方法符合實驗要求，可用于鉍的藥代動力學研究。

2.2 奧美拉唑對鉍的藥代動力學的影響

比格犬po給予BMT(70+250+250)mg和Ome+BMT(40+70+250+250)mg后鉍的平均血藥濃度－時間曲線(圖1)。

比格犬口服BMT或Ome+BMT后，血漿中鉍的濃度約在3 h達峰濃度，隨后鉍的濃度快速下降，12 h時鉍的濃度已降至較低水平?？诜﨎MT后鉍的 cmax為(21.7±5.3)μg·L－1，AUC0－t為(116.3±27.4)μg·h·L－1?？诜?Ome+BMT(40+70+250+250)mg后鉍的 cmax為(37.5±5.4)μg·L－1，AUC0－t為(170.1±30.4)μg·h·L－1。將 cmax，AUC0－t進行對數轉換后進行配對 t檢驗，將 tmax進行非參數法(配對Wilcoxon法)檢驗，結果表明，BMT 和 Ome+BMT 組的 cmax、AUC0－t具有顯著性差異(P＜0.05)，tmax無顯著性差異。比格犬口服Ome+BMT 后鉍的 cmax提高約 73%，AUC0－t提高約46%，說明根除Hp四聯療法中，奧美拉唑能顯著增加比格犬體內鉍的吸收。

Fig.1 Concentration－time curves of bismuth in plasma after po administration BMT and Ome+BMT to Beagle dogs.Beagle dogs were po given BMT(bismuth 70+metronidazole 250+tetracycline250)mg and omeprazole(40 mg)+BMT(bismuth 70+metronidazole 250+tetracycline 250)mg，blood samples were collected before administration and at 0.5，1，2，3，4，6，8，10，12 and 14 h after administration，bismuth concentrations were detected by flame atomic absorption spectrometry.±s，n=6.

3 討論

文獻報道血漿中鉍的測定方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電化學法和電感耦合等離子體質譜法等[10－15]。但是電化學法操作與計算均比較復雜，不能滿足生物樣品高通量分析的要求;而原子熒光光譜法和電感耦合等離子體質譜法雖具有操作簡單和靈敏度高的優點，但實驗儀器昂貴而且實驗成本較高;本文采用火焰原子吸收光譜法測定比格犬血漿中鉍的濃度，方法簡便、快速和準確，且實驗成本低，其檢測靈敏度能夠滿足藥代動力學研究要求。

本實驗選擇硝酸－高氯酸(4∶1，V∶V)為樣品的消解液，并采用120℃下加熱0.5 h，然后升溫至180℃下加熱2 h的消解方法;目的先在較低溫度下使血漿和消解液充分反應，然后升高溫度將血漿中有機成分消解完全并將酸快速揮干。

鉍劑必須在酸性環境中才能起作用，而質子泵抑制劑能抑制胃酸，因此，二者合用時可能發生藥物間的相互作用。Spénard等[16]報道，健康志愿者同時口服甲硝唑、四環素、枸櫞酸鉍鉀三合一膠囊和奧美拉唑之后，鉍的吸收明顯高于不服用奧美拉唑的對照組，AUC提高了約200%，但因僅連續給藥10 d，血漿中鉍在 100 μg·L－1的中毒閾值以下，無鉍中毒現象出現。四聯療法的一般服用時間不會超過15 d，因此并未見過四聯療法長期用藥后導致鉍中毒的報道。張澍田等[17]對大鼠單用膠體果膠鉍和采用四聯療法(蘭索拉唑+膠體果膠鉍+甲硝唑+阿莫西林)14 d，停藥后，鉍在心、腦、腎和肝中的蓄積量，結果表明，四聯療法顯著增加了鉍在腎中的蓄積。張莉等[18]發現，四聯療法(奧美拉唑+膠體果膠鉍+甲硝唑+阿莫西林)中的奧美拉唑能增加鉍在大鼠腎中的蓄積，損傷腎小管細胞的功能。

本研究通過對比格犬口服BMT和Ome+BMT后鉍的藥代動力學行為的比較，考察了四聯療法中奧美拉唑對比格犬體內鉍吸收的影響。結果表明，BMT和 Ome+BMT組的tmax無顯著性差異，但cmax，AUC0－t具有顯著性差異，說明四聯療法中奧美拉唑能顯著增加比格犬體內鉍的吸收，提示在臨床應用四聯療法時應小心慎重，注意觀察是否有不良反應，必要時進行鉍血藥濃度監測，適時調整鉍劑的給藥量或者避免長期用藥，以減少不良反應。

在本研究中并未給出消除半衰期和MRT等參數，Benet等[19]對健康志愿者長期給予鉍劑血漿中鉍達到穩態濃度后體內鉍的處置進行了詳細的研究，認為鉍的處置分為3部分，首先是“分布”半衰期為1～4 h，僅對應4.8%的藥時AUC，其次有一延長半衰期為5～11 d，與67.9%的藥時AUC相關，最后有一個更加延長的半衰期，為20～72 d，與27.3%的藥時AUC相關，由上可知在鉍的消除過程中，第二個延長半衰期間對應的藥時AUC占有最大比例，代表鉍的主要消除與排泄，在鉍的處置中最重要，因此，采用第二個延長半衰期對鉍在體內的穩態濃度和蓄積情況進行描述是最合適的，但通常需要多次給藥，長期采集血漿和尿樣來計算穩態消除半衰期，而以單次給藥計算鉍的消除半衰期是不準確的，也是沒有意義的。本研究的目的是考察四聯療法中奧美拉唑對比格犬體內鉍吸收的影響，因此僅設計了單次給藥，未能給出半衰期。

有文獻曾對枸櫞酸鉍鉀在人體內的藥動學進行過研究，而本研究采用的是膠體果膠鉍，不同鉍劑的吸收速度和吸收程度是存在差異的，通常膠體果膠鉍的吸收程度要遠低于枸櫞酸鉍鉀，其吸收速度也慢于枸櫞酸鉍鉀，有關含膠體果膠鉍的四聯療法中奧美拉唑對體內鉍吸收影響的研究尚未見文獻報道。本文首次對含膠體果膠鉍的三聯和四聯療法中鉍在比格犬體內的藥動學進行了研究。比格犬單次口服BMT后鉍的 cmax為 14.0～29.3 μg·L－1，單次口服 Ome+BMT 后鉍的cmax為29.2～42.7 μg·L－1，上述峰值雖未超過中毒濃度，但考慮到僅單次給藥的cmax即提高約73%，下一步有必要進行四聯療法多次給藥的藥動學研究，以考察鉍的穩態血藥濃度和鉍的蓄積程度，為臨床制定安全有效的四聯療法用藥方案提供參考。

文獻[20]報道，健康志愿者在口服奧美拉唑后胃液的pH值從2.1升高至4.7，進而能夠改變一些pH依賴性藥物在胃內的吸收，因鉍在胃內的吸收即為pH依賴性，故奧美拉唑與鉍劑合用會增加人體內鉍的吸收量。在禁食狀態下，比格犬的胃液和小腸液的pH值、胃排空時間等與人體相近，但比格犬的小腸轉運時間稍小于人體，因而鉍在比格犬和人體內的吸收可能有一定差異，鑒于此，含膠體果膠鉍的四聯療法中奧美拉唑對人體內鉍吸收的實際影響最終還是需要進行臨床研究來驗證。

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