鄰苯二甲酸二乙基己基酯對新生大鼠肺組織發育的影響

應燕芬，胡小婭，梁 園，林 錦，吳海山，蔡曉紅，林振浪，陳尚勤

(1.溫州醫學院附屬第二醫院育英兒童醫院兒科，浙江溫州 325027;2.浙江省臺州醫院兒科，浙江臨海317000;3.Department of Neonatology，4.Department of Pathology，Mount Sinai School of Medicine，New York10029，USA)

鄰苯二甲酸二乙基己基酯〔di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP〕是一種增塑劑，被應用于醫療設備如血袋、靜脈營養給藥袋、氣管插管、鼻飼管和深靜脈置管中。研究表明，在成年和幼年動物中DEHP作為一種影響內分泌的環境干擾物，對生殖、肝、腎和肺發育等具有毒性作用[1－2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)是降解細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的主要介質，與其特異性組織抑制劑即金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)在肺發育過程中共同扮演著重要的角色[3－4]。細胞和ECM的相互作用和ECM的重建對胎肺的發育至關重要，尤其是Ⅳ型膠原為主要成分的基底膜結構變化。MMP-9/TIMP-1主要作用于基底膜的Ⅳ型膠原。MMP-9的過量表達或MMP-9/TIMP-1的表達失衡均可導致肺發育受阻[5－7]。轉化生子因子β(transforming growth factor β，TGF-β)是一組功能復雜的多肽生長因子，在肺支氣管樹分支生成過程和上皮細胞分化過程中起重要作用[8]，其異常表達亦影響肺發育。本研究應用DEHP染毒新生大鼠，探討DEHP對肺發育的影響，并從ECM重建角度探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DEHP和玉米油，Sigma公司;RT-PCR逆轉錄試劑盒，加拿大Fermentas(MBI)公司;PCR引物，上海英駿生物工程公司合成;SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)定量試劑盒，日本TaKaLa公司;Trizol RNA提取液、山羊抗大鼠MMP-9抗體和兔抗大鼠TGF-β1抗體，美國Santa Cruz公司;兔抗大鼠TIMP-1抗體，武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG多聚體或辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG多聚體PV試劑盒，美國GBI公司。實時熒光定量PCR儀，羅氏Light-Cycler?480實時熒光定量PCR系統。

1.2 實驗動物和分組

SPF級Sprague-Dawley新生大鼠120只購自溫州醫學院實驗動物中心，動物許可證號:SCXK(浙)2005-0019，在SPF級實驗室內飼養。隨機分為溶劑對照組及DEHP 10，100 和 750 mg·kg－1染毒組。DEHP染毒組于出生后第1天開始分別ip給予DEHP，溶劑對照組ip給予等體積玉米油，每天1次。每組1/2大鼠持續染毒14 d，另一半持續染毒21 d。各組大鼠出生體質量無明顯差異，均母乳喂養。

1.3 肺組織標本制備

染毒結束后第2天，ip給予戊巴比妥鈉35 mg·kg－1麻醉大鼠，每組隨機取5只，固定，打開胸腔，結扎右主支氣管，取出肺組織，用4%中性甲醛溶液經支氣管給20 cm H2O的氣道壓力進行灌注固定，然后結扎右主支氣管，置于4%中性甲醛溶液固定，48 h后脫水，石蠟包埋，沿肺葉縱軸切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理改變;取鼠左肺組織，分離剪去肺門部大支氣管血管，將肺新鮮標本用冷生理鹽水漂洗去血跡后，濾紙吸干，用錫箔紙包裹好，1 min內迅速置于液氮中保存，轉移至－80℃冰箱儲存用于實時PCR檢測MMP-9，TIMP-1和TGF-β1mRNA表達水平。

1.4 肺組織HE染色形態學觀察和肺間質比例測定

制備肺組織石蠟切片，HE染色，顯微鏡下形態學觀察并照相，使顯微鏡處于同一放大倍數(100倍)及電壓，每張切片隨機選擇5個視野，測量肺間質比例。首先將切片中的大血管，支氣管去除，用數字圖像分析技術分割圖片，調整照片，找到肺間質和肺泡對比最強烈的像素閾值T，T=100，根據每個圖像位點的像素不同，可以分割圖片為肺間質、肺泡和其他，每個視野肺間質的像素與總像素的比值表示肺間質比例。

1.5 實時熒光定量 PCR檢測肺組織 MMP-9，TIMP-1和TGF-β1mRNA 表達

取100 mg新鮮組織，放到研磨器中，加入液氮充分研磨至粉末，加入1 ml Trizol，提取組織總RNA，紫外分光光度計測量 A260nm/A280nm，計算RNA的純度和濃度。Primer 5.0軟件設計引物，TGF-β1的上游引物為5'CCCCTGGAAAGGGCTCAACAC3'，下游引物為 5'TCCAACCCAGGTCCTTCCTAAAGTC3'，擴增產物長度為 136 bp;MMP-9的上游引物為5'ACCCCATGTATCACTACCACGAG3'，下 游引物 為 5'ATAGTGCTGGCTGTGGGGTGTG3'，擴增產物長度為91 bp;TIMP-1的上游引物為5'ATAGTGCTGGCTGTGGGGTGTG3'，下游引物為5'TGATCGCTCTGGTAGCCCTTCTC3'，擴增產物的長度為130 bp;內參β肌動蛋白的上游引物為5'TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT3'，下游引物為 5'CCTAGAAGCATTTGCGGTGCACGATG3'，擴增產物的長度為285 bp。取總RNA 1 μl按逆轉錄操作說明書逆轉錄成 cDNA;取2 μl逆轉錄產物加入20 μl反應體系中，按以下反應條件擴增:95℃預變性30 s→95℃變性10 s→57℃退火10 s→72℃延伸20 s，40個循環，72℃采集熒光信號。用羅氏LightCycler?480實時熒光定量PCR系統進行實時PCR檢測。以2－△Ct表示各組目標基因mRNA相對表達水平。△Ct=Ct目標基因－Ctβ肌動蛋白，Ct為擴增過程中熒光信號強度達到閥值的循環數。

1.6 免疫組化方法檢測肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白表達

取肺組織標本經4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，5 μm 連續切片，60℃烤片 2 h，梯度乙醇脫水，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，依次加入一抗(山羊抗大鼠MMP-9抗體、兔抗大鼠TGF-β1和TIMP-1抗體)，二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG多聚體或辣根過氧化物酶標記兔抗羊IgG多聚體)，DAB顯色，脫水，透明，封片，鏡檢。以細胞漿中沉著棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞。用Imagepro-plus6.0圖像分析軟件測定10個視野中陽性部位的積分吸光度(integrated absorbance，IA)，計算IA平均值以表達待測蛋白的相對表達水平。IA值越大，蛋白表達水平越高。

2 結果

2.1 DEHP對新生大鼠肺發育形態和肺間質比例的影響

Fig.1 Effect of di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP)given for 14 d(A)and 21 d(B)on lung histopathological changes in newborn rats(HE ×100).The newborn rats were ip given DEHP from the postnatal 1st day，once daily，for 14 or 21 d.The solvent control group(DEHP 0 mg·kg －1)was given equal volume of corn oil.1:solvent control group;2，3 and 4:DEHP 10，100 and 750 mg·kg－1 groups，respectively.

由圖1和表1結果看出，DEHP染毒14d，溶劑對照組新生大鼠(圖1A1)肺泡形態發育正常，未見炎癥反應，未見出血;與溶劑對照組比較，DEHP 10 mg·kg－1組(圖1A2)肺間質比例無顯著性差異，肺泡未見明顯炎癥細胞浸潤和出血;DEHP 100和750 mg·kg－1組(圖 1A3 和 A4)可見肺間質增厚，肺泡隔增厚，間質細胞增多，肺間質比例增大(P＜0.05)。DEHP 染毒 21 d ，DEHP 10，100 和750 mg·kg－1組(圖1B2～B4)肺間質比例、肺泡大小和肺間質厚度與溶劑對照組(圖1B1)相比無明顯差異。

Tab.1 Effect of DEHP on lung interstitial tissue proportion of newborn rats

2.2 DEHP染毒對新生大鼠肺組織 MMP-9，TIMP-1和TGF-β1mRNA表達的影響

實時 PCR 結果顯示，MMP-9、TIMP-1、TGF-β1和β肌動蛋白擴增產物的溶解曲線均為特異性單峰，擴增曲線呈“S”型，表明所用引物特異性較好。由表2可以看出，DEHP染毒14 d，隨著染毒劑量的增加，新生大鼠肺組織MMP-9和TGF-β1mRNA表達增加(r=0.979，P＜0.01;r=0.990，P＜0.01)，TIMP-1 mRNA 表達降低(r=0.904，P＜0.01)。DEHP染毒21 d，隨著染毒劑量的增加，MMP-9 和 TGF-β1mRNA 表達降低(r=0.878，P＜0.01;r=0.935，P＜0.01)，TIMP-1 mRNA 表達增加(r=0.819，P＜0.01)。

Tab.2 Effect of DEHP on expression of matrix metalloproteinase 9(MMP-9)，tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1)，and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in lung tissue of newborn rats

2.3 DEHP染毒對新生大鼠肺組織 MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白表達的影響

由圖2看出，新生大鼠肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白免疫組化染色陽性信號均為棕黃色顆粒，定位于胞漿。溶劑對照組肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白在上皮細胞和間質細胞均有表達 (圖 2A1，B1，C1);DEHP 10，100 和750 mg·kg－1染毒14 d，MMP-9 和TGF-β1蛋白在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、血管內皮細胞和肺泡間質細胞表達增加(圖2A2～A4，C2～C4)，TIMP-1蛋白表達減少(圖2B2～B4)。圖像分析結果見表3，可見DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織MMP-9和TGF-β1蛋白表達隨著DEHP染毒劑量的增加而增加 (r=0.770，P＜0.01;r=0.959，P＜0.01)，TIMP-1蛋白表達隨著DEHP染毒劑量的增加而降低 (r=0.795，P＜0.01)。

由圖3看出，溶劑對照組新生大鼠肺組織MMP-9，TIMP-1和TGF-β1蛋白在上皮細胞和間質細胞均有表達(圖3A1，B1，C1)，DEHP 10，100 和750 mg·kg－1染毒 21 d，隨 DEHP 染毒劑量的增加，MMP-9和TGF-β1蛋白在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、血管內皮細胞和肺泡間質細胞表達減少(圖3A2～A4，C2～C4)，TIMP-1蛋白表達增加(圖3B2～B4)。圖像分析結果可見(表3)，MMP-9和TGF-β1蛋白表達隨著DEHP染毒劑量的增加而降低(r=0.904，P＜0.01;r=0.819，P＜0.01)，TIMP-1蛋白表達隨著DEHP染毒劑量的增加而增加 (r=0.619，P＜0.01)。

Fig.2 Effect of DEHP given for 14 d on protein expression of MMP-9(A)，TIMP-1(B)and TGF-β1(C)in lung tissue of newborn rats(×200).See Fig.1 for the rat treatment.1 －4:DEHP 0，10，100 and 750 mg·kg－1group.↑:immunostaining positive cells.

Tab.3 Effect of DEHP on protein expression of MMP-9，TIMP-1 and TGF-β1in lung tissue of newborn rats

Fig.3 Effect of DEHP given for 21 d on protein expression of MMP-9(A)，TIMP-1(B)and TGF-β1(C)in lung tissue of newborn rats(×200).See Fig.1 for the rat treatment.1 －4:DEHP 0，10，100 and 750 mg·kg－1groups.↑:immunostaining positive cells.

3 討論

環境污染物DEHP在人類生活環境中廣泛分布，其污染成為世界范圍內威脅人類健康的重大問題。DEHP可通過多種途徑進入人體，DEHP及其代謝物對機體生殖系統、肺和呼吸系統等均有毒性作用。目前其肺毒性的作用機制尚不清楚。肺泡發育以肺泡壁的變薄以及次級隔的長出、呼吸膜面積的成倍擴大為特征，此過程有賴于細胞、ECM的相互作用和ECM的重建。在肺血管的成熟中ECM的重建也至關重要。MMP-9能特異性地降解ECM中各型膠原、蛋白聚糖和彈性蛋白等[9]。因此，MMP-9/TIMP-1在肺發育過程中通過對ECM的重構而扮演重要角色[3－4]，它們不僅參與胎肺發育早期呼吸道結構的形成和肺分枝形態的發生，而且還參與肺泡化過程中肺泡壁的變薄和膠原蛋白的沉積與更新，同時通過促進肺泡Ⅱ型上皮細胞的遷移以及向肺泡Ⅰ型上皮細胞分化并覆蓋新形成的肺泡間隔，擴大呼吸膜內表面積，促進肺組織發育成熟。而在肺泡化后期，則有益于肺泡結構和功能的維持與穩定。TGF-β是一組功能復雜的多肽生長因子，在肺分支的形態生成過程和上皮細胞分化進而合成表面活性物質的成熟過程中起重要作用[8]。大量研究表明，TGF-β1與支氣管肺發育不良有著密切的聯系。過度表達的TGF-β1可以抑制肺泡Ⅱ型上皮細胞增殖、分化而導致新生鼠肺發育障礙[10－11]。據報道，母大鼠孕期暴露DEHP可導致新生大鼠尿道下裂，陰莖內 TGF-β1的表達增加，且呈劑量依賴性。同時 MMP-9 能激活 TGF-β1，TGF-β1選擇性抑制MMP的表達，誘導TIMP的表達[12]。

本研究結果表明，ip給予新生大鼠DEHP染毒，DEHP對新生大鼠肺形態發育具有毒性作用，且與DEHP的染毒劑量呈一定的相關性。同時研究發現，DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織 MMP-9 mRNA和蛋白表達隨DEHP染毒劑量增加而增加，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織出現明顯的病理改變，即肺泡數目減少，肺泡體積增大，肺間質增厚，肺泡發育受阻;該結果與本研究集體前期研究報道一致[13]。DEHP 染毒 21 d，新生大鼠肺組織MMP-9 mRNA和蛋白表達隨DEHP染毒劑量增加而減少，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織病理改變減輕，即肺泡間質變薄，肺泡隔變薄，肺間質比例接近溶劑對照組。導致該結果的原因之一可能是隨著新生大鼠的發育，各器官功能逐步完善，如肝解毒作用加強;另外，隨著大鼠發育其自身修復功能亦增強;原因之二是染毒14 d時新生大鼠間質性肺炎反應較重，染毒21 d時間質性肺炎反應較輕。因此推測，MMP-9過量表達可能是 DEHP肺形態發育毒性的作用機制之一。

TIMP-1是MMP-9特異性抑制劑。本研究結果表明，DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織 TIMP-1 mRNA和蛋白表達隨著DEHP染毒劑量的增加而減少;DEHP染毒21 d，肺組織 TIMP-1 mRNA和蛋白表達隨著DEHP染毒劑量的增加而增加;這與MMP-9表達的變化趨勢相反。由此可見，TIMP-1對MMP-9的表達有調控作用，這與文獻報道一致[14]。據報道，MMP-9/TIMP-1平衡關系的破壞勢必影響肺組織正常發育，從而發生病理形態變化[15]。由此提示，MMP-9/TIMP-1失衡可能是DEHP肺毒性的作用機制之一。

本研究結果表明，DEHP染毒14 d，新生大鼠肺組織TGF-β1mRNA和蛋白表達隨DEHP染毒劑量的增加而增加，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織出現明顯的病理改變，即肺泡數目減少，肺泡體積增大，肺間質增厚，肺泡隔增厚。DEHP染毒21 d，新生大鼠肺組織TGF-β1mRNA和蛋白表達隨DEHP染毒劑量的增加而減少，DEHP 100和750 mg·kg－1組肺組織病理改變減輕，即肺泡間質變薄，肺泡隔變薄。由此提示，DEHP的肺毒性可能與其導致肺組織TGF-β1異常表達有關。

綜上所述，DEHP染毒可以抑制新生大鼠肺形態發育，其作用機制可能與其影響肺組織MMP-9/TIMP-1平衡以及TGF-β1基因和蛋白表達有關。

[1]Wang KX，Cai HT.Practical Industrial Additives Book(實用工業助劑全書)[M].Beijing:Chemical Industry Press，2001:133-135.

[2]Giam CS，Chan HS，Neff GS，Atlas EL.Phthalate ester plasticizers:a new class of marine pollutant[J].Science，1978，199(4327):419-421.

[3]Vu TH，Werb Z.Matrix metalloproteinases:effectors of development and normal physiology[J].Genes Dev，2000，14(17):2123-2133.

[4]Fassina G，Ferrari N，Brigati C，Benelli R，Santi L，Noonan DM，et al.Tissue inhibitors of metalloproteases:regulation and biological activities[J].Clin Exp Metastasis，2000，18(2):111-120.

[5]Manji JS，O'Kelly CJ，Leung WI，Olson DM.Timing of hyperoxic exposure during alveolarization influences damage mediated by leukotrienes[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，281(4):L799-L806.

[6]Méhats C，Franco-Montoya ML，Boucherat O，Lopez E，Schmitz T，Zana E，et al.Effects of phosphodiesterase 4 inhibition on alveolarization and hyperoxia toxicity in newborn rats[J].PLoS One，2008，3(10):e3445.

[7]Franco-Montoya ML，Bourbon JR，Durrmeyer X，Lorotte S，Jarreau PH，Delacourt C.Pulmonary effects of keratinocyte growth factor in newborn rats exposed to hyperoxia[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297(5):L965-L976.

[8]Bartram U，Speer CP.The role of transforming growth factor beta in lung development and disease[J].Chest，2004，125(2):754-765.

[9]Visse R，Nagase H.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases:structure，function，and biochemistry[J].Circ Res，2003，92(8):827-839.

[10]Zhao QQ，Deng C，Guo CB，Hua ZY，Feng J.Intra-amniotic endotoxin and postborn hyperoxic exposure upregulate transforming growth factor-β1and α-smooth muscle actin in newborn mice lung[J].Acta Acad Med Mil Tert(第三軍醫大學學報)，2010，32(7):642-646.

[11]Jobe AH，Bancalari E.Bronchopulmonary dysplasia[J].Am J Respir Crit Care Med，2001，163(7):1723-1729.

[12]Liu X，Zhang DY，Wu SD，Xiong J，Wei GH.Di(2-ethylhexyl)phthalate induces hypospadic in mice and its effect on the expression of TGF-β1in genital ubercles[J].Chin J Pediatr Surg(中華小兒外科雜志)，2008，29(9):565-568.

[13]Chen SQ，Chen JN，Cai XH，Chen GR，Gao Y，Ge RS，et al.Perinatal exposure to di-(2-ethylhexyl)phthalate leads to restricted growth and delayed lung maturation in newbornrats[J]. JPerinatMed， 2010， 38(5):515-521.

[14]Wei LQ，Dong Y，Li ZH.Effect of atorvastatin on MMP-9 and TIMP-1 levels in bronchoalveolar lavage fluid and serum of rats with bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J].J Zhejiang Univ(Med Sci)〔浙江大學學報(醫學版)〕.2011，40(1):64-70.

[15]Liu XY，Xu G，Xue XD.Dynamic expression and effects of MMP-9 and TIMP-1 on typeⅣcollagen in lung tissue of neonatal rats with hyperoxia-induced CLD[J].China J Mod Med(中國現代醫學雜志)，2008，18(16):2278-2282，2286.