磷酸二酯酶4B在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中的表達與作用

李金優，宋順德，毛連根，曾豆豆，史建蓉，陳季強，李子剛，湯慧芳

(浙江大學醫學院1.浙江省呼吸藥物研究實驗室，2.國家理科基地，浙江杭州 310058;3.附屬兒童醫院，浙江杭州 310003;4.附屬婦產科醫院，浙江杭州 310000)

特發性肺纖維化以彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂導致肺間質纖維化為特征，這種實質病變具有不可逆性和嚴重的致死率，曾被認為是一種慢性炎癥過程。但目前研究表明，纖維化的反應是由異常激活的肺泡上皮細胞驅動，這些細胞產生的介質通過肺部間質細胞的增殖，誘導成纖維細胞和成肌纖維細胞灶形成，吸引循環纖維細胞，誘導上皮間質轉化。成纖維細胞和肌成纖維細胞灶分泌過量的細胞外基質，以膠原纖維為主，造成瘢痕和肺結構的破壞[1]。目前尚無有效的治療手段阻止或逆轉纖維化的過程。因此，尋找在上皮損傷過度修復過程中發揮作用的藥物，成為探索阻止和逆轉肺纖維化過程的關鍵。

磷酸二酯酶(phosphodiesterases，PDE)是細胞內第二信使cAMP和cGMP的水解酶，可維持細胞內第二信使濃度平衡，在信號傳遞過程中發揮重要作用。在肺部疾病中，PDE4是目前關注較多的一個亞型，PDE4有A，B，C和D 4個亞型，其中PDE4B亞型因在炎癥細胞和組織中表達較廣泛而倍受關注[2－3]。據報道，PDE4抑制劑對博來霉素(bleomycin)誘導的肺纖維化模型小鼠有治療作用[4－5]，但由于目前PDE4抑制劑的亞型選擇性不強，究竟是何種PDE4亞型在起作用尚不清楚。本研究采用博來霉素誘導的肺纖維化小鼠模型，研究PDE4B mRNA和蛋白表達在纖維化形成不同時期的變化，同時檢測轉化 生 長 因 子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白細胞介素 6(interleukin-6，IL-6)、巨噬細胞炎癥蛋白2(macrophage inflammatory protein 2，MIP-2)和IL-1β等的分泌，以期闡明PDE4B亞型在肺纖維化過程中所發揮的作用，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和儀器

C57BL/6J小鼠，雄性，7～8周，體質量20～22 g，由浙江大學動物實驗中心提供，動物合格證號:2007000526749。博來霉素，日本化藥株式會社;實時PCR相關試劑包括dNTP混合物、Oligo(dT)18引物、RNA酶抑制劑、M-MLV逆轉錄酶和 SYBR Rremix Ex TaqTM，寶生物工程(大連)有限公司;膠原含量測定試劑盒，英國Biocolor公司;小鼠TGF-β1和MIP-2 ELISA試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性測定試劑盒，南京建成生物工程有限公司;小鼠β肌動蛋白和PDE4B引物，上海生工生物工程有限公司合成;IL-6和 IL-1β ELISA試劑盒，美國 R＆D Systems公司。CFX96型熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司;CM 1850型冰凍切片機，德國Leica公司。

1.2 模型制備和分組

采用4%水合氯醛280 mg·kg－1麻醉小鼠，有創氣道給藥法滴入生理鹽水配制的博來霉素2.5 mg·kg－1。正常對照組滴入等體積的生理鹽水。給予博來霉素后第3，7，14，21和28天處死小鼠，分不同批次進行支氣管肺泡灌洗，留取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)并留取肺組織。

1.3 肺組織病理學觀察

小鼠股動脈放血處死后，留取肺組織用4%甲醛固定，制備石蠟切片，進行Masson染色，觀察肺組織纖維化改變，以確定造模是否成功。Masson染色呈藍色的即沉積的膠原纖維。

1.4 BALF收集和處理

取1 ml生理鹽水灌洗肺組織得到BALF，混勻后取50 μl用于白細胞計數，余下以500×g離心5 min，取上清液分裝，凍存于 －80℃，余下30 μl小心吹勻沉積細胞，均勻涂片，晾干并固定，瑞氏吉姆薩染色，高倍鏡下計數200個白細胞中中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞的數目。

1.5 ELISA測定BALF中炎癥因子含量

取BALF上清液按照ELISA試劑盒說明書測定 TGF-β1，IL-6 和 MIP-2 含量。

1.6 肺組織MPO活性和膠原蛋白含量測定

右肺組織用生理鹽水制備成10%的組織勻漿，取450 μl測定 MPO活性，剩余勻漿于12000×g離心10 min取上清，按照試劑盒說明書測定膠原含量，并取5 μl上清液進行總蛋白含量測定。MPO和膠原含量測定結果皆為上清液每克總蛋白中的MPO活性和膠原含量。

1.7 實時熒光定量PCR測定肺組織中PDE4B mRNA表達

取液氮固定的左肺組織加入1 ml Trizol于冰浴中勻漿，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，于－20℃保存。以cDNA為模板，用PDE4B引物進行實時熒光定量PCR擴增，內參照為β肌動蛋白。小鼠 β肌動蛋白引物，上游(5'-3'):GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC;下游(5'-3'):GACTCATCGTACTCCTGCTTGC。小鼠 PDE4B引物，上游(5'-3'):CCAGTTCCTGTTATCTTC;下游(5'-3'):TCGCAACATGGTACACTG。擴增條件為:95℃10 s，48.9℃30 s，72℃45 s，40 個循環。以β肌動蛋白作為內參照，目的基因的表達用相對定量法計算，即目的基因2－ΔCt/β 肌動蛋白2－ΔCt，其中Ct值是PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數，可通過GeneAmp5700基因序列分析軟件讀出并計算，ΔCt=Ct的平均值－中間值。

1.8 免疫組化法檢測PDE4B蛋白分布

冰凍組織包埋后，切成4 μm切片，室溫30 min后用丙酮固定10 min，PBS清洗，用3%H2O2去除內源性過氧化氫酶。用PBS小心洗5次后使用兔抗PDE4B多克隆抗體4℃孵育過夜，陰性對照組用PBS代替一抗。PBS清洗5次去除抗體，5%BSA封閉10 min。PBS清洗后加入二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗后加入DAB顯色10 min，清洗后加入蘇木精染色5 min，PBS清洗后浸入無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察并拍片，PDE4B陽性部分顯色為棕色。應用Image-Pro Plus圖像分析軟件進行分析，選擇測量積分吸光度(integrated absorbance，IA)。每組6張切片，每張切片隨機選取10個區域，每個高倍鏡視野測5個IA，每組有300個平均IA值。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 博來霉素刺激后肺組織的病理變化

圖1顯示博來霉素誘導致肺組織氣道重塑和纖維化過程。正常對照組小鼠肺組織肺泡結構清晰且完整，無炎癥細胞浸潤(圖1A)。模型組小鼠在纖維化早期(第7天)，主要表現為炎癥細胞浸潤，氣道上皮細胞排列不規則并脫落，肺泡結構少量破壞(圖1C);第14天膠原開始形成，并沉積于氣道附近(圖1D);在纖維化后期(第21天和第28天)，間質細胞大量增殖，膠原大量沉積，肺泡組織結構被嚴重破壞，間隔消失形成空洞(圖1E，F)。上述變化提示肺纖維化模型制備成功。

2.2 博來霉素刺激后小鼠肺組織BALF中白細胞總數和分類的變化

表1為博來霉素刺激后第3，7，14，21和28天小鼠BALF中白細胞總數及中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數目。可以看出，博來霉素刺激后第3天白細胞總數及中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數目均達到峰值，隨后逐漸回落。

2.3 博來霉素刺激后BALF中炎癥因子MIP-2，IL-6，IL-1β和 TGF-β1含量的變化

由表2看出，與正常對照組比較，IL-1β在博來霉素刺激后快速升高(P＜0.01)，第3天達到峰值，之后逐漸回落接近正常水平;IL-6也快速升高(P＜0.01)，在第3天達到峰值，隨后快速回落;MIP-2則隨著時間延長逐漸增加，第28天是對照組的173%(P＜0.01);TGF-β1在第7天達峰值之后逐漸回落。

Fig.1 Bleomycin-induced histopathological changes in lung tissue of mice(Masson staining).On the 3rd，7th，14th，21st and 28th days after the mice were intratracheal instillated bleomycin 2.5 mg·kg －1，the histopathological changes in lung tissue were observed to evaluate lung injury.A:normal group;B －F:3，7，14，21 and 28 d groups，respectively.

Tab.1 Bleomycin-induced changes of total leukocyte and differential cell counts in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)of mice

Tab.2 Bleomycin-induced changes of interleukin-1β (IL-1β)，IL-6，macrophage inflammatory protein-2(MIP-2)and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in BALF of mice

2.4 博來霉素刺激后肺組織MPO活性和膠原蛋白含量的變化

由表3看出，與正常對照組比較，博來霉素刺激后肺組織膠原蛋白含量第3天即開始升高(P＜0.05)，第28天達峰值;肺組織中MPO活性在第3天亦快速升高(P＜0.01)，第14天達峰值，隨后下降，第28天下降至正常水平。

Tab.3 Bleomycin-induced changes of myeloperoxidase(MPO)activity and collagen level in lung tissue of mice

2.5 博來霉素刺激后肺組織中PDE4B mRNA表達的變化

由表4看出，博來霉素刺激后第14天肺組織中PDE4B mRNA表達與正常對照組比較明顯增加(P＜0.05)，第28天達峰值(P＜0.01)。與肺纖維化的發展趨勢相符。

Tab.4 Bleomycin-induced changes of phosphodiesterase 4B(PDE4B)mRNA and protein expression in lung tissue of mice

2.6 博來霉素刺激后肺組織中PDE4B蛋白表達的變化和分布

PDE4B主要在炎癥細胞的胞漿內表達。由圖2看出，正常對照組小鼠肺中中性粒細胞和巨噬細胞等炎癥細胞較少(圖2A);博來霉素刺激后第3天小鼠肺中表達PDE4B的炎癥細胞明顯增多(圖2B)，第7和14天炎癥細胞進一步聚集，并且肺泡上皮細胞中PDE4B也開始表達(圖2C，D)。隨著纖維化程度加深，這一趨勢明顯增加。第21和28天肺內炎癥細胞減少，但肺間質表達增加(圖2E，F)，提示PDE4B不僅在肺纖維早期的炎癥細胞表達，在后期纖維化肺間質也有大量表達。PDE4B蛋白表達增高的趨勢與mRNA表達趨勢相符。由表4看出，與正常對照組比較，博來霉素刺激后第7天PDE4B蛋白表達明顯增加(P＜0.05)，第28天增加更為明顯 (P＜0.01)。

Fig.2 Changes of PDE4B protein expression induced by bleomycin in lung tissue of mice(Immunostaining).SeeFig.1 for the mouse treatments.A:normal group;B － F:3，7，14，21 and 28 d groups，respectively.?:inflammatory cells;↑:lung interstitial cells.

3 討論

PDE4B是主要的 PDE4形式[6]，存在于人單核細胞和中性粒細胞，可由脂多糖特異性的誘導表達[7]，涉及Toll受體信號、脂多糖誘導的單核細胞和巨噬細胞腫瘤壞死因子的分泌、T細胞的活化及Th2細胞因子的產生[8－10]。博來霉素誘導的纖維化與特發性肺纖維化的病理變化相似，是目前應用最廣泛的肺纖維化模型，博來霉素用藥后第14～28天形成肺纖維化[11]。據報道，PDE4抑制劑可以減輕博來霉素導致的肺纖維化[4－5]。但有趣的是羅氟司特可以降低膠原Ⅰ型的轉錄，而西洛司特則不能。這是由PDE4抑制劑對亞型的選擇性差異所致。因此，研究此模型PDE4亞型的表達有重要意義。

本研究發現，博來霉素刺激后第7天，肺組織內聚集大量炎癥細胞，肺泡結構少量破壞;第14天肺泡炎癥細胞浸潤，大量巨噬細胞和淋巴細胞聚集并釋放到肺泡腔，膠原沉積于肺泡間質，表明本研究肺纖維化模型制備成功。BALF中白細胞總數及中性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數目在博來霉素刺激后第3天達到峰值，之后逐漸減少，其中以巨噬細胞為主。在這個過程中，大量的信號因子被釋放出來，誘導肺泡上皮細胞的遷移與增殖。本研究顯示多種細胞因子參與此過程，IL-1β和IL-6在給藥后第3天達峰值，TGF-β1在給藥后第7天達峰值，而MIP-2則呈持續性增長。其中IL-1β主要源于巨噬細胞、單核細胞和上皮細胞，是導致纖維化的主要前炎癥因子之一，IL-1β導致肺泡損傷，促進間質損傷的修復導致的肺損傷和肺纖維化過程中有重要作用，參與 MIP-1α 等多種細胞因子的應答[13]。TGF-β1是主要導致纖維化的細胞因子，可直接作用于成纖維細胞，主要由巨噬細胞分泌[14]。而MIP-2與肺纖維化的形成和血管形成有關[15]。

本研究發現，PDE4B表達在小鼠肺纖維化形成過程中有逐漸升高的趨勢。博來霉素刺激后第14天PDE4B mRNA表達增加，第28天達最高值。PDE4B在前期炎癥反應中主要在炎癥細胞中表達增加，第14天后炎癥細胞進一步聚集，并且肺泡上皮細胞中PDE4B也開始表達，隨著纖維化程度加深，這一趨勢明顯增加。在博來霉素引起的肺纖維化過程中，PDE4B mRNA表達的變化趨勢與肺纖維化程度加深相符，與膠原蛋白沉積和BALF中MIP-2含量的升高等的變化趨勢一致。由此提示，PDE4B的表達增加不僅在肺纖維早期炎癥反應的信號通路中發揮重要作用，在肺纖維化過程后期也可能扮演著重要角色。

綜上所述，PDE4B在博來霉素誘導的小鼠纖維化肺組織中高表達，提示其可能是一個較好的抗肺纖維化藥物的研究靶點。

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