生物學試驗中不同浸提條件下鎳鈦合金中鎳溶出的研究

溫賢濤，賀學英，李劍，湯菊莉，黃永富

北京市醫療器械檢驗所，北京市，101111

0 前言

醫療器械生物學試驗中樣品制備是生物學試驗的第一步，是生物學試驗成功開展的前提，是確保生物學試驗結果真實可靠的保證。醫療器械生物學評價系列標準GB/T1688-12對樣品制備條件進行了推薦，在生物學試驗中常需要使用樣品浸提液進行試驗，即將試驗樣品浸入適宜的介質中，在一定的條件下進行浸提，然后使用浸提液進行一系列的生物學試驗，其目的在于檢測醫療器械可溶出物可能導致的生物學反應，以評價產品可能對病人或使用者的潛在危害。系列標準第12部分對浸提法原理進行了說明，并對浸提容器、浸提介質、浸提條件和方法等均進行了推薦，此方法主要參考藥包材的浸提方法[1-4]。但由于醫療器械的材料、預期用途、使用方法等與藥包材有很大區別，加上醫療器械本身的多樣性，試驗人員應該根據樣品的物理化學特性等選擇相應的浸提條件和方法。目前關于樣品制備條件的研究國內外均開展得不多，可能是由于醫療器械生物學評價體系的建立相對較晚，加上醫療器械的多樣性，醫療器械材料種類眾多，物理化學性能相差很大，一一進行研究，時間成本和經濟成本均太高。

本文以鎳鈦合金材料作為研究對象，進行不同浸提條件下鎳溶出的比較研究。近三十年來，鎳鈦合金以其良好的生物相容性、形狀記憶效應和超彈性等特點，已被廣泛地應用于醫療器械領域[5]。但是由于鎳鈦合金中鎳含量高，鎳溶出是影響鎳鈦合金生物相容性的一個重要因素[6]。本研究選擇兩家醫用鎳鈦合金生產廠家提供的鎳鈦合金絲，以生理鹽水作為浸提介質，分別在GB/T 16886-12推薦的五種條件下進行浸提，采用等離子發射光譜儀（ICP）分析方法檢測浸提液中鎳濃度，比較不同浸提條件對鎳溶出的影響，選擇最優的浸提條件。同時，計算單位質量和單位面積下每天鎳離子析出量，根據GB/T 16886.17推薦的過程[7]，與目前國際已知的鎳毒性限量進行比較，評價鎳鈦合金的生物安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

選用直徑為2mm的鎳鈦合金(Ni/ Ti:55/45)，記材料編號為GM和JS，分別由供應商A和B提供。

1.2 試劑

生理鹽水、蒸餾水、乙醇、多元素標準貯備液(100.0 μg/mL)。

1.3 儀器

iCAP6000等離子發射光譜儀、分析天平、超聲清洗儀、烘箱。

1.4 方法

1.4.1 材料制備

鎳鈦合金絲截成10 mm，用自來水清洗三次，蒸餾水超聲清洗5 min，再用乙醇清洗一次，最后蒸餾清洗三次，37oC烘箱中烘干，干燥器放置24 h以上備用。用10 ml玻璃瓶為容器，稀酸稀堿浸泡后，自來水和蒸餾水分別清洗三次后，37oC烘箱中烘干備用。

1.4.2 浸提

稱取一定量的鎳鈦合金段放入玻璃瓶，按0.2 g/mL的浸提比例加入生理鹽水，在不同浸提條件下進行浸提，每個浸提條件設三個平行樣。浸提結束后，將鎳鈦合金取出，浸提液備用。

1.4.3 鎳濃度分析

標準曲線繪制：用100 μg/mL 多元素標準貯備液配制成100 μg/L，200 μg/L 及300 μg/L 的標準液，上機繪制標準曲線。

濃度分析：進樣管直接取浸提原液進行分析，結果取三個平行樣的平均值。

2 結果與討論

GM與JS鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳離子溶出濃度如表1、表2所示。

表1 GM鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳溶出情況Tab.1 The dissolution of nickel of GM nitinol under different extraction conditions

據表1、表2的鎳溶出情況，可以得出以下實驗結果。(1) 不同浸提條件下所制備浸提液中鎳離子濃度不同。相同溫度條件下，延長浸提時間，浸提液中鎳離子濃度增加。相同浸提時間下，浸提溫度越高，鎳離子濃度增加。可見鎳離子的溶出與浸提時間和溫度成正相關。(121oC,1 h)浸提條件，雖然溫度最高，但由于浸提時間很短，因此析出的離子較少。(50oC,72 h)及70oC,24 h)這兩個浸提條件，溶出離子均明顯高于(37oC,72 h)浸提條件下溶出的離子量，對于GM這種材料(70oC,24 h)溶出離子濃度近(37oC,72 h) 條件下的兩倍。(2) 雖然不同浸提條件下GM和JS兩種材料析出離子濃度的趨勢是一樣的，但同樣浸提條件下析出離子量相差幾百甚至上千倍。(3) 按WHO 1998年報告中數據，每人每天從食物獲得的鎳量為(86～406) μg，從水中獲得的鎳量為(5～25) μg[6]。例如用鎳鈦合金材料制備封堵器約0.5 g或冠脈支架約0.1 g，由于總質量和表面積小，按此實驗得出的數據推算，可判斷這類器械鎳溶出在安全限量以內。

表2 JS鎳鈦合金在不同浸提條件下鎳溶出情況Tab.2 The dissolution of nickel of JS nitinol under different extraction conditions

3 結論

本實驗主要考查了不同浸提條件下鎳鈦合金材料鎳溶出的情況，同時也比較了不同供應商提供的鎳鈦合金鎳溶出情況。實驗發現，16886.12中推薦的五種浸提條件對于鎳鈦合金材料沒有等效性，其中(121oC,1 h)浸提條件下，鎳離子溶出最少，建議今后鎳鈦合金材料的醫療器械產品生物學試驗浸提液制備盡量不選擇該浸提條件，以免不能充分浸提材料中的有害物質。鎳溶出量受浸提時間和溫度的共同影響，沒有特殊情況時，常規浸提建議選擇(37oC,72 h)浸提條件，因為該浸提溫度最接近人體實際溫度，更能模擬臨床應用時的實際情況，72 h的浸提時間比24 h更為充分。(70oC,24 h)條件下離子濃度最高，此條件可作為加速或加嚴浸提時選擇的浸提條件，可以縮短浸提時間，并且鎳溶出量最高。此外，如果使用(70oC,24 h)條件制備的浸提液，在進行生物學評價時，可考慮按比例減少浸提液的用量，得到與(37oC,72 h)條件等效的結果。比如在開展慢（亞慢）性毒性試驗，可減少浸提液的使用量，即減少樣品用量，也盡可能考慮到動物福利的要求，減少每日給藥量，減少動物痛苦。根據目前能查到的鎳毒理數據，結合該實驗中鎳溶出量檢測結果，可以基本確定鎳鈦合金材料是生物安全的，如果一種醫療器械設計時含有較大質量的鎳鈦合金材料，應該慎重。本實驗數據均是在體外靜態浸提條件下得到的，相比體內的生理環境較為簡單，因此在對鎳鈦合金醫療器械進行風險評估時，應充分考慮體內復雜的生理環境，如各種無機離子、酶等蛋白質以及一些特定的生物力學環境等。因此應在下一步實驗中開展體內試驗，從全身毒性和局部反應等方面進行研究，特別是考察鎳鈦合金材料長期植入后的鎳的代謝分布及對局部組織的影響。此外，該實驗還發現即使同樣是鎳鈦合金材料，供應商不同，產品的性能差別很大，鎳溶出可以相差幾百甚至上千倍。因此，建議醫療器械生產企業選擇供貨商時，根據預期產品性能要求及預期用途，對供應商進行充分評價。

[1]ISO 10993-12-2007 Biological evaluation of medical devices-Part 12:Sample preparation and reference materials [S].

[2]ISO 10993-1-2009 Biological evaluation of medical devices-Part 1:Evaluation and testing within a risk management process [S].

[3]GB/T 16886.1-2001 醫療器械生物學評價 第1部分:評價與試驗[S].

[4]GB/T 16886.12-2005 醫療器械生物學評價 第12部分:樣品制備與參照樣品[S].

[5]鄭玉峰,趙連城.生物醫用鎳鈦合金[M].北京:科學出版社,2004.

[6]Mohammed ES,Martha ES,Helge FB.Assessing the biocompatibility of NiTi shape memory alloys used for medical applications[J].Anal Bioanal Chem,2005,381:557-567.

[7]GB/T 16886.17-2005 醫療器械生物學評價 第17部分:可瀝濾物允許限量的建立[S].