南極適冷菌Psychrobacter sp. G普遍脅迫蛋白(USP)基因的克隆及其脅迫條件下的應答特征分析*

宋維志，林學政*，車 帥

(1. 國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；2. 國家海洋局 海洋生物活性物質重點實驗室，山東 青島 266061)

南極生態系統具有獨特的地理環境及氣候特征，如常年低溫、干燥、鹽度高且變化大、強輻射等，生存于其中的南極細菌必須采用獨特的適應機制來應對這種極端的生存環境[1-3]。

普遍脅迫蛋白(Universal Stress Protein，USP)最早在大腸桿菌的雙向等電聚焦電泳中發現，并被命名為C13.5蛋白[4]。研究發現，該基因與大腸桿菌的多種脅迫和饑餓刺激應答反應均相關，包括生長穩定期，C、N、磷酸鹽、硫酸鹽及氨基酸的缺乏，熱激、氧化劑、金屬、酒精、抗生素等有害物質的處理[5]。大腸桿菌USP家族成員包括UspA，UspC，UspD，UspE，UspF，UspG(UspB并不屬于USP家族)[6]。目前所發現的USP大多屬于UspA家族，它能夠形成同型二聚體，在大腸桿菌中還發現了UspA的異型二聚體，這可能是USP具有多種生物學功能的原因[7]。

盡管已經在很多物種中發現USP能被多種脅迫刺激誘導，但其明確的作用機理還不清楚，至今對USP的研究對象主要集中于中溫菌大腸桿菌[6-9]，而對生存于南極這一極端生境的適冷菌的USP的研究尚未見報道。為進一步了解南極細菌的生境適應機制，根據南極適冷菌Psychrobactersp. G的基因組測序草圖，通過設計特異性引物，克隆得到1個USP基因。通過實時定量PCR技術(qRT-PCR)對其在不同脅迫條件下的表達情況進行了研究，以期闡明該基因在南極適冷菌生境適應性中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養基與試劑

南極適冷菌Psychrobactersp. G分離自南極喬治王島西南部的水樣并保存于本實驗室中[10]。

所使用不同鹽度培養基的成份見表1，培養基于1×105Pa下濕熱滅菌20 min。海水取自山東青島海域，鹽度為31。

大腸桿菌感受態細胞DH5α(D9057)、克隆載體pMD18-T(D101A)、RNA提取試劑盒(D9108D)、反轉錄試劑盒(DRR037A)、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit(DRR041A)均購自大連Takara公司；基因組DNA提取試劑盒(DP302)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(DP209-2)均購自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 培養基成份Table 1 Components of culture media

1.2 Usp1141基因的克隆

為獲取Usp1141基因全長及其完整的調控序列，根據菌株Psychrobactersp. G的基因組草圖，選取Usp1141基因起始密碼子ATG上游-500～-600 bp的序列以及終止密碼子TAA下游0～100 bp的序列，利用軟件Primer 5.0設計特異性引物Usp1141-F和Usp1141-R(表2)。PCR擴增反應條件如下：95 ℃ 4 min；42 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個循環； 72 ℃ 10 min，4 ℃保持。PCR產物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒切膠純化后連接到pMD-18T載體并轉化大腸桿菌DH5α。含有插入片段的陽性克隆并由上海桑尼生物科技有限公司完成測序。

1.3 生物信息學分析

擴增得到的Usp1141基因的核苷酸序列通過BLAST(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)與GenBank中已有的序列進行比對分析。啟動子序列(-35區，-10區)、核糖體結合位點(RBS)由Softberry網站(http:∥linuxl.softberry.com/berry.phtml)分析獲得[11]。蛋白等電點(pI)、分子量(MW)由Lasergene-EditSeq(v.1.02; DNASTAR Inc.)計算得出。使用Lasergene序列分析軟件包(v.1.02；DNASTAR Inc.)中的MegAlign,將Usp1141與其他菌種UspA進行多序列比對，所選取的UspA分別來自于Psychrobacterarcticus(YP_265125),Moraxellacatarrhalis(YP_003627803)，Pseudomonasstutzeri(YP_001172977)、Methylomicrobiumalcaliphilum(YP_004916566)、Dichelobacternodosus(YP_001208950)，Cardiobacteriumhominis(ZP_05705139)，Saccharophagusdegradans(YP_527252)，Acinetobacterbaumannii(ACJ41690)和Escherichiacoli(ACT43718)。選取與菌株G進化關系較近菌株的UspA蛋白，使用軟件Mega 4.0中的鄰接法(neighbor-joining method，NJ)構建系統發育樹，通過自展檢測法(bootstrap test)評估所構建的系統發育樹的可靠性[12]。

1.4 脅迫處理

首先將菌株G在最適生長溫度(20 ℃)和鹽度(45)條件下培養，待培養液OD600達到0.5時(指數生長期)，進行如下的脅迫處理：1)溫度脅迫：將菌株分別于0、10 和30 ℃培養，并分別于2，6和12 h時取樣并于-80 ℃保存。2)鹽度脅迫：將OD600為0.5的培養液于20 ℃下8 000 g離心5 min，收集菌體。將獲得的菌體分別重懸于與離心前體積相等的、鹽度分別為0，15，90和120的培養基中。重懸后的菌體于20 ℃繼續培養2，6和12 h后取樣并于-80 ℃保存。3)溫度鹽度協同脅迫：按照鹽度脅迫的操作方法，將OD600為0.5的培養液分別于如下條件下繼續培養：溫度0 ℃，鹽度15；溫度30 ℃，鹽度15；溫度0 ℃，鹽度90；溫度30 ℃，鹽度90。菌株于上述條件下繼續培養2，6和12 h后取樣并于-80 ℃保存。最適生長條件(溫度為20 ℃，鹽度為45)下繼續培養的菌株于相同時間點(2，6和12 h)取樣設為對照，進行基因差異表達分析。

1.5 Usp1141 基因表達分析

利用RNA提取試劑盒提取總RNA，獲得的總RNA的質量通過測定其A260/A280值確定。使用PrimeScript RT Reagent Kit 將得到的500 ng RNA反轉錄為cDNA。使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒進行實時定量分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase,GAPDH)基因作為內參基因[13-14]。使用軟件Primer 5.0設計Usp1141基因和GAPDH基因實時定量PCR引物，引物Usp1141-QF、Usp1141-QR、GAPDH-QF、GAPDH-QR序列詳見表2。qRT-PCR儀為Stratagene Mx3000P qPCR System，反應條件如下：95 ℃，5 s；47 ℃，15 s；72 ℃，20 s，40個循環；72 ℃ 10 min,4 ℃保持。所有實驗均重復3次。基于臨界循環值(Ct)對mRNA進行定量，采用相對Ct值法(2-ΔΔCt)進行數據處理，對照組Usp1141基因的表達量標準化為1[15]。使用SPSS 16.0對樣本的重復性以及樣本間的差異進行統計分析。P>0.05時，樣本間不存在顯著性差異；0.01

表2 基因克隆和qRT-PCR引物Table 2 Primers used in the gene cloning and qRT-PCR analysis

2 結果與分析

2.1 Usp1141基因核苷酸及蛋白氨基酸序列分析

根據南極適冷菌Psychrobactersp. G的基因組測序草圖和功能注釋，發現一個UspA基因(Usp1141)。通過設計特異性引物，克隆到了該基因的全長序列。基因序列測定表明，該基因ORF長462 bp，編碼153個氨基酸，理論蛋白分子量為17 kDa，pI值為5.23。啟動子序列-35區(5′-ATGAAA-3′)和-10區(5′-TAGTAAAAT-3′)分別位于-304 bp和 -276 bp處，起始密碼子上游11 bp處有一個典型的RBS序列(5′-AGGA-3′)(圖1)。Usp1141基因序列及推導的氨基酸序列已提交GenBank，獲得的序列注冊號為JQ782515。多序列比對結果表明，Usp1141的氨基酸序列與其他已知物種的UspA氨基酸序列存在相似性很高的保守區；Usp1141的二級結構為交替排列的4個α螺旋和5個β折疊；與ATP結合相關的氨基酸殘基分別位于β1,β2,β4,α4和β5上(圖2)。

從構建的系統發育樹可以看出，Usp1141與來自同屬菌株Psychrobacterarcticus273-4的UspA進化關系很近，與同科菌株MoraxellacatarrhalisRH4的UspA進化關系次之，而與Escherichiacoli和Bacillussubtilis的UspA的進化關系則較遠(圖3)。

黑體加下劃線代表-35區、-10區和RBS;黑體代表起始密碼子ATG和終止密碼子TAA圖1 Usp1141基因全長序列及其推導的氨基酸序列Fig. 1 Full-length nucleotide sequences and deduced amino acid sequences of Usp1141 gene

序列上方橫線代表4個α螺旋和5個β折疊；序列下方的黑線代表與ATP接觸的氨基酸殘基(A: 腺嘌呤； R: 核糖；P: 磷酸基團； D: 二聚物表面)圖2 Usp1141與其他菌種UspA的多序列比對Fig. 2 Sequence alignment of Usp1141 with other representative bacterial UspA

圖3 Usp1141的系統發育分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of Usp1141

2.2 Usp1141基因對溫度脅迫的應答特征

qRT-PCR研究結果表明，溫度對Psychrobactersp. GUsp1141基因的表達基本沒有影響。無論是低溫(0，10 ℃)還是高溫(30 ℃)處理，其表達均沒有顯著性變化(圖4)。

圖4 Usp1141基因對溫度脅迫的應答特征Fig. 4 Expression characteristics of Usp1141 gene in response to temperature stresses

圖5 Usp1141基因對鹽度脅迫的應答特征Fig. 5 Expression characteristics of Usp1141 gene in response to salinity stresses

2.3 Usp1141基因對鹽度脅迫的應答特征

當培養基鹽度(0，15)低于菌株G生長的最適鹽度時，Usp1141基因的表達會受到顯著抑制。當培養基鹽度為0且處理時間為12 h時，其表達量最低，僅為對照的0.25倍；當培養基鹽度(90，120)高于菌株生長的最適鹽度時，Usp1141基因的表達水平則會顯著升高；當鹽度為120且處理時間為6 h時，其表達量為對照的2倍(圖5)。

2.4 Usp1141基因對溫度和鹽度協同脅迫的應答特征

圖6 Usp1141基因對溫度和鹽度協同脅迫的應答特征Fig. 6 Expression characteristics of Usp1141 gene in response to combined stresses of temperature and salinity

當培養基鹽度低于菌株生長的最適鹽度時，無論溫度低于還是高于最適溫度，Usp1141基因的表達均受到抑制。當培養溫度為0 ℃，培養基鹽度為15時，其表達受到顯著抑制，僅為對照的0.15倍；當培養溫度為30 ℃,培養鹽度為15，處理時間為2 h時，其表達量僅為對照組的0.41倍。當培養基鹽度高于菌株生長的最適鹽度時，無論溫度低于還是高于最適溫度，Usp1141基因的表達水平均會提高。當培養溫度為0 ℃，培養基鹽度為90的培養條件時，基因表達量會顯著升高，并在6 h后達到對照組的1.8倍；當培養溫度為30 ℃，培養基鹽度為90時，基因表達量在前2 h內無明顯變化，但在隨后的10 h內，其表達量會顯著提高，達到對照組的1.7倍(圖6)。

3 討 論

極地生態系統的獨特性為研究極端條件環境下微生物的適應機制提供了極好的資源。南極細菌Psychrobactersp. G分離自南極喬治王島西南部的水樣中，其最適生長溫度為20 ℃，當溫度高于30 ℃則完全停止生長，表明該菌屬于適冷菌。本研究從Psychrobactersp. G中克隆得到了1個USP編碼基因Usp1141。

多序列比對結果表明，Usp1141的氨基酸序列與其他已知物種的UspA氨基酸序列存在相似性很高的保守區，并發現有與結合ATP相關的氨基酸殘基(圖2)。這些表明Usp1141可能與其他UspA蛋白發揮類似的生物學功能，并通過與ATP結合來發揮作用[16]。進化樹分析表明，Usp1141與同屬的Psychrobacterarcticus 273-4的UspA進化關系較近，與同一科的Moraxella catarrhalis RH4(YP_003627803)的UspA進化關系次之，這與上述菌株基于16S rRNA的系統進化關系基本一致(圖3)。

實時定量PCR研究表明，溫度變化對Usp1141基因的表達基本沒有影響(圖4)，與之不同的是，熱激處理會誘導中溫菌大腸桿菌UspA的表達[5]，這表明適冷菌Psychrobactersp. G可能采取其他機制來適應外界溫度的變化，如在低溫下誘導冷激蛋白的表達[17-19]，高溫下誘導熱激蛋白的表達等[20-21]。當培養基鹽度低于菌株生長的最適鹽度時(0，15)，Usp1141基因的表達會受到顯著抑制；而高鹽度(90，120)下其表達量則會顯著提高(圖5)。這表明Usp1141可能在菌株G對滲透壓變化的適應性中發揮作用。在自然條件下，南極細菌通常需要同時面對多種環境壓力，如在南極地區，溫度變化通常伴隨著鹽度變化[3]。因此對溫度鹽度協同脅迫下Usp1141基因的表達情況也進行了研究。結果表明，Usp1141基因在溫鹽協同脅迫下的表達情況與在溫度和鹽度單因子影響時的表達情況基本一致，即Usp1141基因表達量的變化與溫度無關，低鹽度會抑制其表達，而高鹽度會誘導其表達(圖6)。

盡管USP已經在很多物種中發現，但其明確的作用機理還不清楚。且之前的研究主要集中于嗜中溫菌大腸桿菌[6, 8-9]，對南極適冷菌的USP的研究目前尚未見報道。南極適冷菌Psychrobactersp. G 的生存環境與大腸桿菌完全不同，本研究對闡明適冷菌中USP的作用機理有一定意義。

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