化學分類法在淡水超微型浮游植物多樣性研究中的應用

李家園 ，侯建軍， 胡 俊 ， 史曉蕓

(1. 湖北師范學院 生命科學學院，湖北 黃石 435002;2. 華東師范大學 河口海岸學國家重點實驗室， 上海 200062)

0 引言

依據粒徑譜的劃分慣例[1]：粒徑在0.2～2μm的浮游植物為微微型浮游植物(picoplankton)；粒徑在2～20μm的浮游植物為微型浮游植物(nanoplankton)；另外，考慮到許多真核生物的粒徑在2～5μm之間，有人提出了用超微型浮游植物(ultraphytoplankton)來定義小于和等于5μm的浮游植物，因此超微型浮游植物包括全部的微微型浮游植物和粒徑在2～5μm的微型浮游植物。超微型浮游植物在世界范圍內分布極廣，不同營養鹽水平的湖泊中都普遍存在[2]。不論是冰雪覆蓋的極地還是熱帶亞熱帶地區，在水生態系統中超微型浮游植物都扮演著重要的初級生產者。雖然個體微小，但其生長快、數量多、周轉速率快，可以維持高的生產力，從而成為生物地球化學循環中重要的成員；它們被一些異養鞭毛蟲和纖毛蟲攝取后，可間接成為大型浮游動物的食物，借此進入經典食物網，最終影響漁業的產量。超微型浮游藻類群落的組成和豐度是水體生態學狀況的重要指標。

1 淡水超微型浮游植物多樣性研究現狀

1.1 淡水超微型浮游植物研究現狀

關于超微型浮游植物的研究大多集中于對海洋聚球藻、原綠球藻等微微型原核浮游植物的研究，并且關于超微型真核浮游植物的研究相對原核要滯后近10年[3]。國內王建等[4]率先開展了針對我國淡水水域的超微型藻類生態學研究；此后郭贛林等[5]以及中國科學院南京地理與湖泊研究所的張運林[6]分別對淡水超微型浮游植物的初級生產力和生物量等方面也有很好的研究。Paerl[7]于1975～1976年利用14C同位素標記法結合掃面電子顯微鏡技術對新西蘭北島和南島共11個淡水湖泊的超微型浮游植物進行了超微型浮游植物對總生物量的貢獻及其初級生產模式的研究，但是由于研究技術手段限制，該研究并沒有獲得其類群組成信息；Wehr[8]對紐約Calder湖不同粒級藻類受N、P及N/P影響差異進行了現場營養加富實驗的研究，結果表明超微型浮游植物能夠更有效地利用水環境中的營養物質，在不同粒徑中的藻類群落中具有較強競爭力；Stenuite等[9]曾利用流式細胞技術和熒光顯微鏡技術對非洲東部的坦噶尼喀湖兩個不同站點的光合自養超微型浮游植物及異養超微型浮游植物動力學展開研究；Tamás等[10]于2003到2005年利用熒光顯微鏡技術和分子遺傳多樣性研究技術對中歐喀爾巴阡山脈盆地三個不同地區湖泊共十個站點的光合超微型浮游植物進行了監測。因受有關研究方法的限制，相對于超微型浮游植物在淡水生態系統中的作用，對于其組成和豐度的研究卻沒有引起足夠的重視。

1.2 淡水超微型浮游植物生物多樣性研究方法比較

經典的藻類分類方法基本是以形態學方法為主，既借助光學顯微鏡，采用細胞計數板對樣品進行分類和計數。此方法在較大粒徑藻類的分類鑒定中一直發揮著重要作用，但也存在一些問題[11]，比如對操作者經驗要求高、需要制作玻片樣本、容易損壞某些藻類、大量樣品的檢測需要耗費較多的人力和時間；而對于個體微小的超微型浮游藻類卻無法用常規方法來準確鑒定并計數。通過透射和掃描電鏡的方法能對超微型浮游植物形態學特征進行鑒定，但前處理較繁瑣，成本昂貴，很難應用于大范圍、高通量樣本的檢測工作。流式細胞分析技術(Flow Cytometry, FCM)是精確計數超微型浮游植物非常有效的手段，但很難用來區別真核浮游植物的種類組成，細胞聚集及碎屑熒光干擾也都會影響檢測結果；基于遺傳基礎的分子標記技術亦不依賴于經典的形態學基礎，對于DNA的提取方法要求較高，雖其靈敏度較高，但由于一些假陽性因素的存在，使分析結果中藻類種類和數量偏高；原位熒光雜交技術(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)是采用與特異性序列互補的熒光或放射性標記的寡核苷酸探針，協同熒光顯微技術或流式細胞技術來鑒定各種分類水平上復雜樣品中的遺傳多樣性的分析技術，因此實驗操作繁瑣耗時，工作量大，而且不能保證樣品中的藻類達到100%的雜交；相比較之下，化學分類法有無可替代的優勢。

1.3 色素化學分類法研究淡水超微型浮游植物生物多樣性的優勢

生物體的化學成分是化學分類法的依據和基礎。諸如脂肪酸、氨基酸、蛋白質、糖類、色素等，而光合色素以其在浮游藻類種群分布的特異性引起研究者的關注。依據光合色素的化學結構，可將其分為三類：葉綠素類、類胡蘿卜素類、藻膽蛋白類。從功能上可將類胡蘿卜素分為光合色素和光保護色素，光合類胡蘿卜素(PSC)通常包括以下幾種：巖藻黃素、青綠藻黃素、19'-己酰基氧化巖藻黃素、19'-丁酰基氧化巖藻黃素、多甲藻素、和α-胡蘿卜素；光保護類胡蘿卜素(PPC)主要包括硅甲藻黃素、別藻黃素、硅藻黃素、甲藻黃素、葉黃素、新黃素、玉米黃素和β-胡蘿卜素 。特征色素在不同類群中的分布不同[12]，并且只存在于特定浮游植物類群中，如甲藻中的多甲藻素，青綠藻中的青綠藻黃素，藍藻和綠藻中的玉米黃素，定鞭金藻中的19'-己酰基氧化巖藻黃素等。隨著高效液相色譜(HPLC)技術的發展，利用反相高效液相色譜分析藻類的色素組成，以總葉綠素a的量代表總生物量，特征色素與葉綠素a的比值通過一定的數學運算可以指示特定的浮游藻類對浮游植物總生物量的貢獻，進而確定某種種群的豐度和組成。基于HPLC色素分析的化學分類法以其操作簡便、自動化程度高、效率高、可進行大規模和高通量分析的優點而受到廣大研究者的青睞。利用HPLC能夠很好地對色素進行分析，對藻類的種類和粒徑沒有限制。這對于超微型浮游植物的豐度組成研究將具有重要的意義。此方法在海洋浮游藻豐度和組成的研究中應用較廣，國內外對淡水藻的相關研究也開始逐步重視。

2 色素化學分類法研究淡水浮游植物生物多樣性的應用

2.1 色素化學分類法配套算法論證分析

浮游植物的化學計算方法有多元線性回歸法、迭代法、矩陣因子法，這三種方法受特征色素與葉綠素a的初始比值影響較大，而這個比值又與光照及營養鹽水平所引起的藻類細胞生理學狀況密切相關，CHEMTAX的產生較好地解決了這一難題，它采用多次運算的方式，減少其對初始色素比值的依賴，使結果向"真實值"收斂，從而提高結果的準確性[13]。

Mackey等[14]對CHEMTAX程序進行了評估，他們通過對色素比例及初步計算數據導入隨機性錯誤，來模擬HPLC分析中由于色素濃度的誤差而導致的特征色素與葉綠素a比值誤差以及在HPLC操作分析過程中產生的誤差，結果顯示，此程序很成功地用于浮游植物豐度及組成分析，值得注意的是，在缺少特征色素二乙烯基葉綠素a、二乙烯基葉綠素b的情況下依然可以檢測到原綠球藻，而用傳統方法卻無法檢測到原綠球藻，這一點無疑十分重要。Latasa[13]用8個特征色素比值的原始矩陣，對已知特征色素比值40個樣品的色素濃度數據進行多次了運行來驗證CHEMTAX對原始色素比值分析的靈敏度及其對浮游植物類群分析的有效性，雖然計算結果與真實值有些出入，但隨著運算次數的增加，結果可以向真實值靠攏。Guisande等[15]對廣布于亞馬遜、安第斯山、加勒比等不同區域湖泊、池塘、沼澤十六個站點的樣品進行色素分析，并結合CHEMTAX程序運算來評估樣品中淡水藻類的豐度及組成，結果顯示，除了玉米黃素與葉綠素a的比值外，大部分藻類的特征色素與葉綠素a的比值基本不隨水環境及季節的差異而變化，實驗得出的平均特征色素比例矩陣并結合CHEMTAX計算，可對不同營養鹽狀況下淡水環境中藻類種群的豐度和組成進行評估。

2.2 色素化學分類法研究淡水浮游植物生物多樣性的案例分析

Andersen等[16]曾對超微型浮游藻類樣品分別進行HPLC色素分析、掃面電子顯微鏡和熒光顯微鏡的觀察。研究發現在上層水域中，掃描電子顯微鏡鏡檢結果和HPLC分析結果一致，但是隨深度增加，分析結果相似度下降，這可能是由于深度變化引起的藻類細胞內色素含量變化導致特征色素與葉綠素a的比值變化引起的，因此HPLC方法可以用于藻類豐度、組成的研究。另外，Fietz等[17]將淡水浮游植物的色素數據分別用多元線性回歸法和CHEMTAX進行計算。此兩種方法在主要藻類組成上并無顯著性差異。作為重要研究成果之一，他還從樣品中發現并分離出了一種紫黃素含量極高的超微型隱藻(Eustigmatophyceae)。Descy等[18]應用HPLC-CHEMTAX對坦噶尼喀湖中的藻類豐度進行了為期兩年的監測，發現藻類種群、豐度組成隨空間變化差異很大。同樣，為驗證HPLC-CHEMTAX是否能夠用來鑒定淡水浮游藻類的類群豐度和組成，Schluter等[19]在不同光照強度條件下培養了20種具有代表性的淡水單種藻，并用來研究藻類色素與類群組成和豐度的關系。結果發現，除玉米黃素/葉綠素a和別藻黃素/葉綠素a的比值外，其他特征色素與葉綠素a的比值均不受光照的影響，通過CHEMTAX計算出來的藻類生物量與光學顯微鏡鏡檢結果一致，并且CHEMTAX還能檢測到一些光學顯微鏡沒有觀察到的藻類。

國內相關研究方面，劉紅和謝平等[20]利用HPLC對武漢東湖淡水水域的光合色素進行了分離分析，結果表明可以通過定量光合輔助色素來精確描述湖泊優勢浮游植物的生物量，其和相應標志色素之間的相關系數高達0.96.侯燕松等[21]等通過HPLC分析了淡水中常見藻類的主要相關色素，表明其均可作為分類的依據，并通過具體的實驗驗證了該方法，顯示其應用于淡水藻類的分類鑒定是可行的。

3 色素化學分類法應用于淡水超微型浮游植物研究的問題及展望

化學分類法操作簡便、自動化程度高、可進行大規模和高通量分析，并且HPLC能夠準確地對色素進行分離分析，對藻類種類和粒徑沒有限制。隨著HPLC分析技術不斷發展，越來越多的藻類色素被發現，鑒于此，需要繼續改善分離分析條件，優化色素的分離方法和穩定保存方法，建立一種更加完善的色素分離分析方法，從而使各研究之間的結果更具可比性。

在淡水藻類尤其是超微型藻類的組成和豐度研究中，一方面，由于淡水區域浮游植物的種類組成與海洋中有很大差別，其特征色素與葉綠素a的比值肯定存在較大差異。而CHEMTAX軟件所附帶的特征色素與葉綠素a的比值矩陣源于海水藻類，這一數據直接被套用到淡水領域的合理性仍需進行驗證，應慎重使用。因此，獲得淡水浮游植物各類群的特征色素與葉綠素a的比值矩陣是開展淡水浮游植物化學分類法工作首當其沖的任務。另一方面，由于浮游植物特征色素與葉綠素a的比值受環境光照及營養條件的影響較大，開展淡水超微型浮游植物的室內生態實驗，獲得各類群浮游植物在不同生長周期、光照條件、營養條件下的特征色素與葉綠素a的比值變化情況，對于不同環境條件下的現場數據分析具有重要的指導意義。當然，超微型浮游植物難以單獨培養，因此獲得以上數據較為困難，我們可以通過對現場樣品的超微型藻類進行實驗室混合培養，采用流式細胞儀進行分選后獲得單一藻類，并進行色素組成及含量的分析，以期獲得各類群特征色素與葉綠素a的比值范圍，進而對CHEMTAX的計算過程進行優化，并嘗試將其推廣至超微型浮游植物的類群分析及豐度檢測中，使其能可靠地應用于淡水超微型浮游植物生物多樣性研究。另外，由于一種特征色素可能分布在幾種不同的藻類，如巖藻黃素在硅藻、金藻、定鞭金藻中都有分布，雖然可以通過不同藻類中它與葉綠素a的比值不同來進行快速、高通量的定量分析，但要實現對藻類的精確鑒定和分類，還需將熒光顯微鏡分析或流式細胞技術及分子生物技術結合起來使用。

總之，利用化學分類法能有效地實現對超微型浮游藻類的豐度和組成進行快速和大量研究。將這些結果與環境理化因子等數據結合起來，可以實現對研究目標水域超微型浮游植物的豐度、組成、多樣性及其與環境因子的互動關系進行研究，從而弄清楚一些超微型浮游植物的分布成因及與地理環境關系、演替規律和生態動力學過程，并進一步深化我們對超微型浮游植物這一特定生物類群生態功能及其在生物地化循環中作用的認識。

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