不同痰標本處理方法對結核分枝桿菌羅氏培養檢測結果的影響

趙立平 朱瑪 姜廣路 于霞 黃海榮

目前，結核病仍然是全球范圍內嚴重的公共衛生問題之一［1］。據 WHO統計，2002年世界1／3的人口已感染結核分枝桿菌［2］，據估算，每年約有200萬例患者死于結核病［3］。結核病的早期診斷和快速治療對疾病的控制至關重要，診斷的延誤必然導致病情惡化，并增加結核病傳播的風險［4］。結核分枝桿菌培養是結核病細菌學檢查的重要方法，被認為是診斷結核病的金標準。目前在我國各級結核病診斷實驗室中，基于羅氏培養基的固體培養是最常用的培養方法之一。本研究分析采用簡單法和離心法處理痰標本，以及采用離心法處理痰標本時不同離心條件對羅氏培養檢測結果的影響，以尋求目前情況下最適合我國結核病實驗室操作的技術。

材料和方法

一、臨床標本的來源

選取2010年9月至2010年11月在北京市結核病胸部腫瘤研究所國家結核病臨床實驗室進行細菌學檢查的疑似結核病患者痰標本198份，其中顯微鏡檢查涂片陽性者99份，涂片陰性者99份；男143例，女55例。年齡范圍10～91歲，平均年齡（48．4±19．9）歲。

二、方法

1．儀器和試劑：恒溫培養箱（型號：SKP08B，黃石市恒豐醫療器械有限公司）；渦旋振蕩器（型號：vortex-2，Scientific Industries）；搖床 （型號：培英HZ-E，太倉市實驗設備廠）；離心機（型號：CR21GⅢ，HITACHI）；氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、谷氨酸鈉、枸櫞酸鎂均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2．羅氏培養基的制備：酸性羅氏培養基和中性羅氏培養基的制備參見參考文獻［5］。

3．羅氏培養基簡單法培養：取1ml痰標本，加入1～1．5倍體積4%NaOH溶液進行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，振蕩混勻后室溫孵育15min。100μl處理后的樣品直接接種至酸性羅氏培養基斜面上，每份標本平行接種2管酸性羅氏培養基。37℃溫箱培養8周，每周觀察記錄結果。

4．羅氏培養基離心法培養：取1ml痰標本，加入1～1．5倍體積 N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉（NaOH-NAC）混合溶液進行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩10～20s，直至痰標本充分液化；將離心管室溫靜置15min；加入PBS中和至體積為40ml，分別采用5種不同的離心條件：①3000×g離心15min（一般常規所用離心條件）；②3000×g離心8min；③3000×g離心25min；④2000×g離心15min；⑤5000×g離心15min。100μl處理后的樣品分別接種至中性羅氏培養基斜面上。每份標本平行接種2管中性羅氏培養基。37℃溫箱培養至8周，每周觀察記錄結果。

5．結果判定：（1）初生長時間的判定：首次發現培養基斜面上有菌落生長的時間確定為初生長時間。（2）污染率的判定：以標本的份數為計算單位，同一份標本的2個接種管均污染時認為污染，若只有單只接種管污染則不認為污染。污染率＝污染份數／樣本數×100%。

6．質量控制（簡稱“質控”）：質控菌株 H37Rv（ATCC 27294）為國家結核病臨床實驗室保存菌株，將生長至對數期的H37Rv菌株用生理鹽水比濁至0．5個麥氏濃度，取1ml比濁好的菌液，處理方法同痰標本，分別接種100μl至中性或酸性羅氏培養基。若質控菌株培養結果為陽性，說明質控合格，否則質控結果不合格。

7．統計學分析：采用SPSS 13．0統計軟件進行分析，計數資料采用卡方檢驗進行分析，非正態分布的計量資料采用秩和檢驗進行分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1．不同處理方法的培養結果和污染率：任何一種方法培養陽性即認定標本培養陽性，198份痰標本中共有126份培養陽性，其中97份來自涂片陽性痰標本，29份來自涂片陰性痰標本。126份培養陽性的痰標本中，簡單法的培養陽性率93．65%（118／126），與一般常規所用離心條件（3000×g離心15min）培養陽性率96．03%（121／126）相比，兩者差異無統計學意義（χ2＝0．146，P＝0．702）。在125份離心法培養陽性的標本中，3000×g離心15min、3000×g離心8min、3000×g離心25min、2000×g離心15min、5000×g離心15min 5種不同離心條件下培養陽性率分 別 為 96．03%、89．68%、95．24%、92．06% 和96．03%（表1）。選取的198份痰標本中，簡單法總體污染率為3．03%（6／198），離心法3000×g離心15min的污染率為3．54%（7／198），兩者間差異無統計學意義（χ2＝0．074，P＝0．785）。

2．不同處理方法的培養結果初生長時間：由于6組不同處理方法的初生長時間數據為非正態分布（Kolmogorov-Smirnow正態性檢驗結果，P值均＜0．05），故采用秩和檢驗來進行統計分析。6種不同處理方法初生長時間的差異有統計學意義（χ2＝187．63，P＜0．001）。再進行組內兩兩比較，將α值矯正為0．0033（0．05／15）。簡單法（118份陽性）與一般常規所用離心條件3000×g離心15min（121份陽性）的初生長時間之間的差異有統計學意義（Z＝-4．81，P＜0．001）。5種不同離心條件下初生長時間差異有統計學意義（χ2＝118．73，P＜0．001）。其余4種離心條件下的初生長時間與簡單法的比較結果如表2所示。

表1 標本不同處理方法處理后的羅氏培養結果

表2 標本不同處理方法處理后的結核分枝桿菌初生長時間

討 論

結核分枝桿菌的病原學檢查是結核病臨床診斷的最重要的依據［6］。目前我國結核病診斷實驗室仍以痰涂片顯微鏡檢查和分枝桿菌羅氏培養最為常用。痰涂片顯微鏡檢查雖簡單、快速，但敏感度較低，痰涂片檢查陽性只能說明痰中含有抗酸桿菌，不能區分死菌與活菌。結核分枝桿菌的培養相對于涂片顯微鏡檢查具有較高敏感度，目前仍然作為結核病診斷的金標準，并且結核分枝桿菌培養還是后續開展的藥物敏感度試驗、分枝桿菌菌種鑒定、基因分型，以及各種基礎研究的前提。培養的優勢還體現在，能夠針對各種臨床標本進行檢測，包括痰液、胸、腹腔積液、腦脊液、尿液和膿液等。基于以上原因，結核分枝桿菌培養技術在未來仍將作為一項重要的診斷技術，所以，對這項傳統技術的全面評價，并著力于提高技術的診斷效率，仍然有很大的現實意義。

羅氏培養中離心法是先對臨床標本進行相應的離心等技術處理，以便對其中的細菌進行沉淀濃縮，從理論上講可提高標本培養的陽性率。den Hertog等［7］發現不恰當的離心（轉速過低或是時間過短）均會導致培養陽性率的降低，同時認為離心的最低條件為3200×g離心22min，但該實驗缺少臨床標本的數據支持。本研究首次就臨床標本在不同離心條件對離心法培養的影響進行比較，結果發現不同離心條件下結核分枝桿菌的初生長時間的差異有統計學意義（χ2＝118．73，P＜0．001），離心力或離心時間降低均會導致初生長時間延長。但不同離心條件下，陽性率有明顯差別，3000×g離心15min、3000×g離心8min、3000×g離心25min、2000×g離心15min、5000×g離心15min，5種不同離心條件下培養 陽 性 率 分 別 為 96．03%、89．68%、95．24%、92．06%、96．03%。由此可知當離心力或是離心時間降低均對陽性率有影響。

離心法3000×g離心15min和簡單法在初生長時間的差異有統計學意義（Z＝-4．81，P＜0．001），且簡單法的平均生長時間比離心法要短2d。簡單法總體污染率為3．03%（6／198），離心法3000×g離心15min的污染率為3．54%（7／198）。

綜上所述，羅氏培養過程中，簡單法檢出陽性率與離心法接近，但簡單法操作相對簡單、污染率較低，初生長時間也相對較短，因而可能更符合臨床的需要；應用離心法進行羅氏培養時，無論是離心力或是離心時間的變化對培養的陽性檢出率均有影響。

［1］World Health Organization． Global tuberculosis control，WHO report 2002．Geneva：World Health Organization，2002．

［2］Sudre P，ten Dam G，Kochi A．Tuberculosis：aglobal overview of the situation today．Bull World Health Organ，1992，70（2）：149-159．

［3］Frieden TR，Sterling TR，Munsiff SS，et al．Tuberculosis．Lancet，2003，362（9387）：887-899．

［4］Sreeramareddy CT，Panduru KV，Menten J，et al．Time delays in diagnosis of pulmonary tuberculosis：a systematic review of literature．BMC Infect Dis，2009，9：91．

［5］World Health Organization．Laboratory services in tuberculosis control．Part III：Culture．Geneva：World Health Organization，1998．

［6］馬玙，朱莉貞，潘毓萱．結核病．北京：人民衛生出版社，2006：104-109．

［7］den Hertog AL，Klatser PR，Anthony RM．Buoyant density of Mycobacterium tuberculosis：implications for sputum processing．Int J Tuberc Lung Dis，2009，13（4）：466-471．