姜黃素對人宮頸癌細胞株Hela細胞增殖的作用的研究以及p53表達的影響*

姜智慧 陸曉媛 周健

姜黃素（Curcumin）是一種酚類化合物，提取自姜科姜黃屬植物姜黃（Curcumalonga）的根莖中，是中藥姜黃的主要成份。國內外的科學研究表明，姜黃素具有具有抗炎、抗氧化、保肝、保護心臟、預防血栓和抗腫瘤的多種生物學效應[1-4]。姜黃素可以調節多種腫瘤相關的細胞因子及通路達到抗腫瘤的作用，對宮頸癌細胞具有一定的細胞毒作用[5]。但是有關姜黃素對宮頸癌細胞體外作用的相關機制仍有待研究。本文主要探討姜黃素對人類宮頸癌Hela細胞的相關作用，檢測p53蛋白的表達情況，為姜黃素防治宮頸癌提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 細胞 人宮頸癌Hela細胞株（中國醫學科學院血液病研究中所惠贈）。

1.2 主要試劑 姜黃素、二甲基亞砜（DMSO）、MTT購自美國Singma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖型購自美國Gibco公司；RT-PCR 反應試劑盒北京天根生化科技有限公司；高純總RNA快速提取試劑盒（RTL-離心柱型）購自上海銳捷生物工程有限公司；蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；p53抗體購自美國Bioworld Technology公司;鼠抗β-actin抗體北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 細胞培養 宮頸癌Hela細胞株采用加入100 mg/L 鏈霉素和100 U/L 青霉素各1 ml的DMEM培養液，置于 37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，待細胞長至體積占細胞瓶體積比約 95%時，按1：2～3比例傳代。取細胞生長良好，活性大于98%的細胞進行后續試驗。

1.4 姜黃素對Hela細胞增殖影響的檢測 用MTT法檢測姜黃素對Hela細胞增殖影響。用含有10%胎牛血清的DMEM培養液將的Hela細胞配成 1×105/ml的懸液，在96孔板中加入 100μl細胞懸液，設5個平行孔。實驗組加入不同濃度的姜黃素使其最終濃度為5、10、20、30、40、50μmol/L，同時設置對照組，分別培養12、24、48 h。培養結束后加入MTT（5 mg/L）20μl繼續培養4 h，小心吸出孔內上清液100 μl，每空加入DMSO150 μl，震蕩使結晶充分溶解，酶標儀測定讀取Hela細胞的A490值，并按下述公式計算細胞增殖抑制率，重復實驗3次以上。抑制率（%）=（1-給藥組 A490值/對照組A490值）×100%。

1.5 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞細胞中p53基因 mRNA 轉錄水平表達的影響的檢測 用RT-PCR法檢測細胞中p53基因 mRNA 轉錄表達水平。收集姜黃素最終濃度為0、10、20、30、40 μmol/L的24 h Hela細胞為樣本。用離心柱法提取總的RNA，根據紫外分光光度計260nm處的吸光度值測定RNA的純度，并進行RNA的定量配成相同濃度的RNA，取1 μg總RNA進行逆轉錄，以cDNA為模板，進行PCR。引物由上海生工生物工程有限公司設計合成見表1。p53基因擴增的反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min；循環36次；72℃再延伸10 min。β-actin 反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s；63℃退火30 s；72℃延伸1 min；循環36次；72℃再延伸10 min。PCR 產物經 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像系統保存圖像，重復實驗3次后，Quantity One 系統進行灰度分析。見表1。

表1 各基因PCR 反應的引物序列

1.6 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞中p53蛋白含量表達的影響的檢測 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞細胞中p53蛋白水平表達的影響的檢測用Western blotting法檢測細胞中p53蛋白表達水平。收集姜黃素最終濃度為0、10、20、30、40 μmol/L的24 h三個時段Hela細胞為樣本。用RIPA細胞裂解液裂解細胞，蛋白提取試劑盒提取蛋BCA法進行蛋白定量，將所有蛋白樣品調至等濃度。取25 μl蛋白樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳，經 SDS-PAGE分離后，電轉移至 PVDF膜上， 常規步驟封閉、洗膜后加入1∶1 000 稀釋的兔抗人p53抗體；1∶1000 稀釋的鼠抗β-actin 抗體，4℃冰箱放置孵育過夜；TBST洗滌，加入1∶500 稀釋的HRP 標記的山羊抗兔/小鼠 IgG，室溫孵育2 h；ECL 底物化學發光顯色后曝光顯影，通過 Bio-rad 化學發光成像系統進行曝光分析。

1.7 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組數據間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，各變量之間的關系采用直線相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

圖1 不同濃度姜黃素對人類宮頸癌Hela細胞的抑制率

2.1 姜黃素對人類宮頸癌Hela細胞增殖的影響 MTT檢測結果顯示，于對照組相比，濃度為5 μmol/L的姜黃素對Hela細胞增殖的抑制作用不明顯；濃度大于10 μmol/L時抑制作用明顯；當濃度達到40 μmol/L時抑制作用最為顯著；但當濃度達到50 μmol/L時抑制作用增加不明顯。試驗表明經不同濃度姜黃素處理不同時間后，Hela細胞的增殖均受到明顯抑制，抑制率見表2，差異有統計學意義（P<0. 05）。表明姜黃素對人宮頸癌Hela細胞的增殖具有抑制作用，且呈劑量-時間依賴性。見圖1。

表2 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞的抑制率（±s）

表2 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞的抑制率（±s）

*與對照組相比， P<0.05

組別 12 h 24 h 48 h對照組 0.030±0.001 0.029±0.040 0.110 0.022* 0.129±0.010* 0.290 0.001* 0.254±0.029* 0.396?±0.149 5 μmol/L 0.093± ±0.010*10 μmol/L 0.125± ±0.144*20 μmol/L 0.230±0.002* 0.394±0.006* 0.416±0.008*30 μmol/L 0.442±0.021* 0.455±0.013* 0.481±0.007*40 μmol/L 0.559±0.016* 0.580±0.018* 0.647±0.007*50 μmol/L 0.573±0.004* 0.583±0.011* 0.681±0.027*

2.2 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞細胞中p53基因 mRNA 轉錄水平表達的影響的檢測 取0、10、20、30、40 μmol/L姜黃素作用人宮頸癌Hela細胞24 h后，RT-PCR得到的p53 mRNA電泳條帶見圖2，條帶經Quantity One 軟件后發現，姜黃素作用后的Hela細胞中p53基因mRNA轉錄和表達水平隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而顯著增加，灰度值見表3。與對照組相比，差異具有統計學意義（P<0.05）。

表3 不同濃度姜黃素作用24 h時p53 mRNA/β-actin相對灰度比值的情況（±s）

表3 不同濃度姜黃素作用24 h時p53 mRNA/β-actin相對灰度比值的情況（±s）

*與對照組相比， P<0.05

姜黃素濃度（μmol/L） p53mRNA/β-actin相對灰度比值0 0.427±0.005 10 0.479±0.004*20 0.537±0.007*30 0.605±0.006*40 0.655±0.007*

圖2 不同濃度姜黃素作用24 h后p53 mRNA的表達

2.3 姜黃素對人宮頸癌Hela細胞中p53蛋白含量表達的影響的檢測 取0、10、20、30、40 μmol/L姜黃素作用人宮頸癌Hela細胞作用24 h后，用Western blotting測得p53蛋白的表達隨著姜黃素濃度的增加而增多，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖3。

圖3 不同濃度姜黃素作用24 h后p53蛋白的表達情況

3 討論

姜黃是是天然存在的多酚類化合物，一種常用中藥，其主要成分姜黃素被用于食品行業作為食品添加劑，又因其為黃色的粉末，被染料業廣泛應用。姜黃素曾經被傳統的印度醫生用來治療厭食癥，鼻炎、咳嗽，鼻竇炎、肝損害[6-7]。近年來，姜黃素由于抗腫瘤的活性引起了國內外學者的廣泛的關注。單獨應用姜黃素時發現，姜黃素有著抗腫瘤活性，同時具有抑制腫瘤轉移和侵襲的作用[8-9]。姜黃素對體外培養的白血病細胞、乳腺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞和卵巢癌細胞均有抑制增殖及誘導凋亡作用[10]，對表皮生長因子的促增殖作用有一定的拮抗效果[11]。還能抑制實驗動物模型中多種腫瘤的發生[12]，并且能縮腫瘤大小，顯著減少腫瘤數目，降低肺轉移及淋巴轉移。試驗表明姜黃素能夠抑調節腫瘤發病的相關基因，對腫瘤生長的的3個階段即：啟動期，加速期，對數期都有一定的抑制作用[13]。因此，姜黃素是目前化學預防和治療腫瘤研究的熱點之一，有望成為一種具有廣泛應用前景的抗癌新藥。

隨著化療藥物的使用，其毒副作用也不可忽視，如脫發、電解質紊亂、口腔黏膜潰瘍和白細胞數降、惡心、腹瀉等。同時腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性也逐漸加強，姜黃素是唯一未見任何毒副作用報道的抗腫瘤藥物。姜黃素可以減少化療藥物對正常細胞的傷害，從而降低藥物的毒副作用，且有一定的化療增敏作用[14]。在聯合應用姜黃素和奧沙利鉑的體外試驗中時發現，姜黃素在明顯提高奧沙利鉑抗腫瘤作用的同時，還可以降低腫瘤細胞對奧沙利鉑的耐藥性[15]。在肝癌細胞的體外實驗中，姜黃素分別于順鉑及阿霉素聯合應用，結果顯示姜黃素與順鉑聯合的效果較好，并且可以下調c-IAP、Bcl-xl、c-myc、NAIP 和 XIAP等細胞因子，誘導細胞凋亡[16]。姜黃素同時體內外的宮頸癌細胞具有一定的抑制及誘導凋亡的作用[17-18]。本文以人宮頸癌Hela細胞為標本，加入不同濃度姜黃素后發現，姜黃素對Hela細胞有著一定的抑制作用，且呈時間-濃度依賴性，不同組別之間兩兩比較，差異有統計學意義（P<0.05）。加入姜黃素后的宮頸癌Hela細胞，從正常的長梭狀，逐漸縮小、變成圓形，同時核固縮，核碎裂逐漸增多。

野生型p53基因（wtp53）是重要的抑癌基因之一，位于17號染色體短臂，編碼53kD核磷酸蛋白，p53蛋白通過調節相關蛋白參與細胞周期調控，阻止細胞從G期進入S期擴增，對細胞分裂及增殖起負調節作用。但是在體內外致癌因素作用下，p53可發生突變，導致wtp53喪失功能成為變異性p53。突變的p53具有致癌的特性，它失去對細胞的抗凋亡能力，對細胞的過度增殖達不到阻滯作用，這就導致細胞在致癌因素的刺激誘導下可以無限制的增殖，發展成為腫瘤。對于p53的相關研究認識后，學者們開發研究出一中抗癌新藥：重組人p53腺病毒注射液。臨床研究表明，單獨或者聯合應用重組人p53腺病毒對胃癌[19]、肝癌[70]、宮頸癌[21]、惡性腹水[22]等，有著較為明顯的治療效果。本論文主要研究不同濃度姜黃素作用下人宮頸癌Hela細胞中p53基因表達的情況的表達情況。取姜黃素濃度為0、10、20、30、40μmol/L作用24 h的Hela細胞為樣本，測樣本中p53mRNA的含量，結果可見隨著濃度的增加p53mRNA的含量逐漸增加；Western blotting結果顯示，隨著姜黃素濃度的增加p53蛋白含量明顯增加。可見姜黃素可能通過誘導抑癌基因p53的表達，導致p53蛋白含量的增加，促進癌細胞的凋亡，從而達到抑制宮頸癌Hela細胞的作用。

[1]Anand P， Sundaram C， Jhurani S， et al. Curcumin and cancer： An“old-age” disease with an “age-old” solution[J]. Cancer Lett， 2008，267（1）： 133-164.

[2]Anand P， Thomas SG， Kunnumakkara AB， et al. Biological activities of curcumin and its analogues （congeners） made by man and Mother Nature[J]. Biochem Pharmacol， 2008， 76（11）： 1590-1611.

[3]Aggarwal BB， Harikumar KB. Potential therapeutic effects of curcumin， the anti-inflammatory agent， against neurodegenerative，cardiovascular， pulmonary， metabolic， autoimmune and neoplastic diseases[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2009，41（1）：40-59.

[4]Srivastava RM， Singh S， Dubey SK， et al. Immunomodulatory and therapeutic activity of curcumin[J]. Int Immunopharmacol， 2011，11（3）：331-341.

[5]35. Notarbartolo M， Poma P， Perri D， et al. Antitumor effects of curcumin， alone or in combination with cisplatin or doxorubicin， on human hepatic cancer cells. Analysis of their possible relationship to changes in NF-kB activation levels and in IAP gene expression[J].Cancer Lett，2005， 224（1）： 53-65.

[6]Rahman I， Biswas SK， and Kirkham PA.Regulation of in?ammation and redox signaling by dietary polyphenols[J]. Biochem Pharmacol ，2006，72： 1439-1452.

[7]Tirkey N，Kaur G，Vij G，and Chopra K.Curcumin，a diferuloylmethane， attenuates cyclosporine-induced renal dysfunction and oxidative stress in rat kidneys [J].BMC Pharmacol ，2005， 15：20.

[8]Aggarwal BB， Kumar A. Bharti AC. Anticancer potential of cuecumin ：preclinical and clinical studies[J].Anticancer Res，2003，23（1A）：363-398.

[9]余俚瑤，張慶華.姜黃素抑制宮頸癌HeLa細胞增殖的機制[J].腫瘤防治研究，2011，38（8）：899-902.

[10]曹澤毅.子宮頸癌治療的變遷和思考[J].現代婦產科進展，2005，14（1）：1-5.

[11]Reuter S，Eifes S，Dicato M，et a1.Modulation of anti-apoptotic and survival pathways by curcumm as a stramgy to induce apoptosis in cancel cells[J].Bioehem Pharmaeol，2008，76（11）：1340-1351.

[12]許剛，黃文姜.黃素防治腫瘤的機制研究進展[J].國外醫學生理病理科學與臨床分冊，2003，23（2）：152-154.

[13]Singh S and Khar A. Biological effects of curcumin and its role in cancer chemoprevention and therapy[J]. Anticancer Agents Med Chem，2006，6： 259-270.

[14]Ajay Goel ，Bharat B， Aggarwa. Curcumin， the Golden Spice From Indian Saffron， Is a Chemosensitizer and Radiosensitizer for Tumors and Chemoprotector and Radioprotector for Normal Organs[J].Nutrition and Cancer， 2010，62（7）， 919-930.

[15]Howells LM， Mitra A， and Manson MM. Comparison of oxaliplatinand curcumin-mediated antiproliferative effects in colorectal cell lines[J].Cancer ，2007，10（2）：40.

[16]Notarbartolo M， Poma P， Perri D， et al. Antitumor effects of curcumin， alone or in combination with cisplatin or doxorubicin， on human hepatic cancer cells： analysis of their possible relationship to changes in NF-kB activation levels and in IAP gene expression[J].Cancer Lett ，2005，224：53-65.

[17]Zhao J， Zhao Y. Effects of curcumin on proliferation and apoptosis of human cervical carcinoma Hela cells invitro[J].Chinese Journal of Cancer Research，2004，16（3）：225-228.

[18]Zhao J ，Zhao Y， Zhang Y， et al. Anti-tumor effect of curcumin on human cervical carcinoma Hela cells in vitro and in vivo [J].Chinese Journal of CancerResearch，2007，19（1）：32-36.

[19]Xie YS， Zhang YH，Liu SP， et al.Synergistic gastric cancer inhibition by chemogenetherapy with recombinant humanadenovirus p53 and epirubicin： an in vitro and in vivo study[J]. Oncol Rep，2010，24（6）：1613-1620 .

[20]Guan YS，La Z ，Yang L ，et al.p53 gene in treatment of hepatic carcinoma： status quo[J].WorldJ Gastroenterol，2007，13（7）：985-992.

[21]王婷婷，韓春俠，鄭小莉. 重組人p53腺病毒注射液聯合順鉑對宮頸癌HeLa細胞增殖及VEGF表達的影響[J].徐州醫學院學報，2012，32（2）：120-123.

[22]阮冬梅. 重組人p53腺病毒治療癌性惡性腹水的研究[J].中外醫學研究，2011， 9（4）：32-33.