Smad蛋白研究進展

龐莉 王晶 蔣延文

轉化生長因子β（transforming growth factor betas，TGFβs）超家族分布于人體各個系統，是調節細胞分化成熟過程的極其重要的一類生長因子。它對于多種細胞功能都有調節作用，其調節功能涉及到胚胎發育、對疾病和傷害的反應、成熟個體穩態的保持等多個方面，細胞的遷移、生長、分化和細胞凋亡等一系列狀態[1]。TGFβs超家族的成員有抗苗勒氏管激素（anti-Muellerian hormone， AMH）、TGFβ、激活素、nodal、抑制素（Inhibins）以及骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins， BMPs）等等40余種[2-3]。早期研究已經顯示，Smad蛋白能夠被TGFβ誘導細胞膜受體直接激活，形成轉錄復合物，進一步控制轉錄核內的靶基因轉錄（見圖1），細胞的多種分化成熟過程被調節。因此，它不但成為了TGFβ信號通路中的重要部分，同時共同調節細胞功能，通過匯合其他信號通路。近年來發現其與多種疾病尤其是多種惡性腫瘤發生、發展相關[2]。

1 Smad蛋白家族

1.1 組成和結構 大約500個氨基酸組成Smad蛋白，包含球形結構域兩個，1個連接區。N-末端結構域（又稱“mad-同源體1”，MH1）在所有R-Smad和Smad4中高度保守，而在Smad6和7中則例外。在不同的亞族中，C-末端（又稱為MH2結構域）同MH1結構域一樣高度保守[4]，但連接區的變化較大。人類和小鼠基因組中各自編碼了8個Smad蛋白。Smad蛋白1、5和8屬于TGFβs家族中AMH和BMPs的通路受體底物[5]，Smad2和Smad3是激活素、TGFβ、Nodal通路的受體底物。Smad4為所有R-Smad提供輔助。Smad6和Smad7能夠干擾和破壞Smad-受體或者Smad-Smad連接形成復合物，屬于抑制性Smad蛋白。Smad1、Smad2、Smad3、Smad5以及Smad8是受體調節Smad蛋白（receptor regulated Smads， RSmads），作為 TGFβs受體底物參與了哺乳動物信號傳導通路[6]。

圖1 TGFβs信號傳導通路

有研究通過X線分析了Smad蛋白MH1和MH2的空間結構，所有R-Smad和Smad4中都是借助一個高度保守-發夾結構與MH1結構域鏈接。而Smad2蛋白含量最多的剪接體中，一段外顯子3編碼的插入片段能夠阻止Smad蛋白與DNA結合。高度保守的Smad蛋白MH2結構域參與了信號轉導過程中多種蛋白的相互作用。MH2結構表面的親水區作用是控制核孔復合物（nuclear pore complex）、胞質內蛋白以及DNA結合輔助因子之間的相互作用。R-Smads C-末端含有保守的絲氨酸-X-絲氨酸模體，可以被磷酸化，鏈接受體和N末端形成了一個“口袋”狀結構。橫跨連接區和MH2模體區的部分被認為是Smad4蛋白激活區（Smad4 activation domain， SAD）能夠調節轉錄激活和抑制因子的相互作用[7-8]。

1.2 Smad錨蛋白 目前發現的促進Smad蛋白與受體相互作用的幾種錨蛋白中，作用最大的是Smad受體激活錨蛋白（smad anchor for receptor activation， SARA）[9]，它在細胞膜及早期內涵體膜上錨定Smad2/Smad3蛋白，以促進與激活的TGF相結合[10]。同時，還可通過特殊FYVE結構域蛋白-Hgs，與SARA一起借助協同作用促使Smad蛋白磷酸化。雖然Smad1/Smad5/Smad8與BMPs通路有關，但到目前為止仍然沒有證據顯示該通路上存在SARA樣因子，幫助激活的受體與RSmad蛋白相結合[9]。

2 磷酸化與去磷酸化

2.1 Smad磷酸化受TGF受體激酶調控 TGF受體復合物活化后促進Smad蛋白磷酸化是TGF信號傳導關鍵性的一步。TGF與TGFⅠ型（TR-Ⅰ）和Ⅱ型受體（TR-Ⅱ）成對結合，形成異源四聚體受體復合物，該復合物中TR-Ⅱ將TR-ⅠN末端的一個絲氨酸/蘇氨酸富含區-GS區磷酸化。TR-Ⅱ在配體誘導的受體復合物中連接到TR-Ⅰ GS區，催化蘇-蘇-絲-甘-絲-甘-絲氨酸中的蘇氨酸（或絲氨酸）殘基磷酸化[11]）。磷酸化的GS區轉變為Smad2/3結合區[12]，再次促使Smad2/3磷酸化傳遞信號。一個包含R-Smad蛋白MH2 L3環結構（L3loop）和Ⅰ型受體激酶結構域中L45環結構（L45loop）的特殊區域決定了R-Smad的底物特異性。L45loop決定磷酸化的GS區驅動受體特異性，調控與R-Smad相互作用。

位于R-Smad C末端的序列絲-纈-絲氨酸（在Smad2蛋白是絲-蛋-絲氨酸）發生受體調節的磷酸化反應，TGF-/Smad信號通路的標志就是這種磷酸化的絲氨酸-X-磷酸化絲氨酸結構，該模體既可以出現在Ⅰ型受體磷酸化的R-Smad蛋白C末端，也可以出現在Ⅱ型受體磷酸化的Ⅰ型受體GS區，此外，該模體還可以與C末端羧基配對形成雙磷酸-絲氨酸結構，此結構可以同Smad4蛋白MH2區“口袋”結構連接[13]，構成R-Smad-Smad4寡聚體進入細胞核，達到調節靶基因轉錄目的。

2.2 去磷酸化過程 刺激TGF/BMP 15～30 min后，Smad2/Smad3磷酸化水平達到穩定狀態（BMP通路中是Smad1/Smad5/Smad8）。當濃度穩定數小時后，細胞外TGF/BMP水平因受體失活或負反饋調節降低而逐漸導致Smad2/Smad3去磷酸化。Inman研究發現，存在一種快速受體去磷酸化回到細胞膜過程，那么當再次受到TGF/BMP等刺激時，則再次磷酸化脫離細胞膜磷酸化Smad蛋白水平逐漸通過循環達到穩定水平[14]。伴隨著R-Smad-Smad4復合物的解離回到胞，細胞核內R-Smad蛋白去磷酸化。R-Smad蛋白調節同時包含，受體磷酸化-去磷酸化循環過程，細胞質內磷酸化的受體與Smad4蛋白形成復合物進入細胞核，進而調節靶基因轉錄，去磷酸化解離復合物，返回細胞質。RSmad蛋白去磷酸化后與細胞核內結合位點的親和力降低，由細胞核內向細胞質遷移；與之相反，磷酸化后降低了與胞質錨定點親和力的RSmad蛋白，解離后轉移到細胞核內，由此在細胞核和細胞質之間穿梭往返[8]。確保了受體不斷被磷酸化激活。

2.3 Smad蛋白調節 Smad蛋白活性受磷酸化C末端MH2結構域和磷酸化連接區來實現。R-Smad蛋白連接區包含多個可以被多種激酶（如ERK MAP激酶）磷酸化的絲氨酸和蘇氨酸位點，磷酸化后的R-Smad則對信號的反應減低。R-Smad蛋白連接區的變異較大，使得上一級信號的選擇性調控成為了可能。Zavala-Gongora R等[15]的報道連接區可迅速將Smad蛋白和幾種不同的通路鏈接，但具體機制尚不十分清楚。

3 轉錄過程

3.1 形成轉錄復合物 R-Smad蛋白被受體磷酸化后并與Smad4蛋白形成復合物成為許多靶基因調節的關鍵因素，Smad蛋白需要與DNA連接輔助因子結合獲得與DNA高度親和力，然后該復合物才可以通過MH1結構域完成連接到DNA這一過程。

1998年，學者Zawel等[15]在一項研究中發現，DNA上特殊的5’-GTCTAGAC-3’序列可以和Smad蛋白結合，進一步研究中證實該序列為5’-GTCT-3’（或者是5’-AGAC-3’），簡稱SBE。許多Smad靶基因啟動子區帶有SBE，X線分析其空間結構后，證實Smad蛋白通過發夾結構與SBE結合。因為單一的SBE不能提供足夠的親和力以促進Smad蛋白結合，所以啟動因子區通常帶有多個SBE結構，可通過多個MH1與多個SBE結合以獲得足夠的DNA結合力[16]。所有的R-Smad蛋白和Smad4均可直接與DNA結合，同時，MH1結構域中的發夾結構可以調節Smad3蛋白與SBE的結合能力，發夾結構插入DNA螺旋結構大溝中，與SBE上的3個核苷酸通過氫鍵結合在一起[16]。和所有的R-Smad蛋白一樣，Smad4的-發夾結構高度保守，這說明Smad蛋白與靶基因的結合不具有多樣性。在脊椎動物中，其發夾結構的附近含有Smad2蛋白3號外顯子編碼的插入片段，它可以阻止Smad蛋白與DNA的結合；反之，缺少插入片段的剪接體則可以與DNA結合。

R-Smad-Smad4寡聚體調節Smad蛋白復合物的活性，通過分析包含C末端絲氨酸殘基證實，兩個磷酸化的R-Smad蛋白分子與一個Smad4蛋白分子形成異源三聚體構成寡聚體[17]，在X線分析復合物中磷酸化的MH2結構域中獲得了相同的結論。在對體內內源性Smad轉錄復合物的分析中發現，復合物的組成表現的更為復雜，因受到與復合物中的其他因子和不同靶基因的影響，可形成異源二聚體和三聚體。

并不是所有TGF/BMP通路中靶基因都具有典型的SBE結構，一些靶基因只是在一定程度上可以通過類似序列與MH1結構域相結合。通過X線空間結構分析發現，在5’-GTCT-3’結構中的第二位堿基T并不參與MH1結構域結合，因此，其他堿基替代T[16]。在一些基因啟動子區，Smad蛋白復合物識別GC富含區，可以和啟動子區GCCGnCGC序列相結合。位于Smad6基因啟動子區的BMP反應元件（BMP-responsive element， BRE）中存在4個GC富含模體，且互相重疊，因此可以和GCCGnCGC序列結合，但是，并非Smad1/Smad5/Smad8結合在GC富含模體上，而是Smad2/Smad3與SBE相結合，GC富含模體具有“Smad1結合元件”的功能。SBE和GC富含模體同時參加才能促使Smad1-Smad4復合物和Smad3-Smad4復合物連接在Id1基因啟動子區[18]。

3.2 Smad蛋白作用 結合于靶基因啟動子特定區域的Smad蛋白轉錄復合物調節轉錄活性是通過直接招募轉錄合作激活因子或抑制因子而得以實現的[19]。除此之外，還存在另外一些調節方式，如Smad蛋白與DNA結合因子合作調節自身基因的表達和Smad蛋白直接與激活因子或者抑制因子作用等等[20]。

轉錄激活能力需借助與異源Gal4 DNA結合結構域（Gal4 DNA-binding domain， GBD）連接Smad1和Smad4蛋白MH2結構域。融合有GBD的全長Smad1蛋白并不能激活轉錄，但是由于BMP信號通路激活后作用于內源性Smad蛋白，其進入細胞核與融合的Smad蛋白相作用，卻往往能夠產生對靶基因強大的轉錄活性[20]。

Smad蛋白可以通過廣泛地與輔助激活因子相互作用，將各種激活信號進行整合。白細胞抑制因子 （leukemia inhibitory factor， LIF）通過與BMP2協作誘導星形膠質細胞分化過程，刺激結合于它們信號通路下游P300不同部位的STAT3和Smad1，于整合信號后誘導膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）基因啟動子激活來獲得實現[21]。

Smad蛋白并不僅僅具有轉錄激活作用，其在某種特定條件下還可以發揮轉錄抑制作用，例如，Smad蛋白調節的基因轉錄抑制作用于TGF信號通路對c-Myc基因的調節過程中[22]，這種抑制作用幾乎出現在所有的細胞類型中，其發生是通過E2F4或E2F5與DP1形成的異源二聚體與Smad3、Smad4組成的復合物，連接于c-Myc基因TIE上，從而實現抑制DNA的轉錄目的。

3.3 選擇靶基因 在與不同的DNA結合因子結合后，被激活的RSmad-Smad4復合物能夠高親和力和選擇性的連接到靶基因啟動子區。以下4種水平上DNA輔助因子可以調節Smad蛋白復合物結合的特異性：（1）轉錄作用特異性；（2）細胞類型特異性；（3）通路特異性；（4）靶基因特異性。

倘若靶基因啟動子區包含足夠的SBE，即使只存在Smad蛋白復合物靶基因也可能被激活，例如Smad7基因啟動子區中含有2個重復的SBE，TGF和BMP通路都可以直接激活該基因[19]。

3.4 轉錄的強制性 早期研究發現，Smad轉錄因子活性受到幾種機制限制，一種是下調轉錄機制，在TGF通路中的存在一種轉錄抑制因子——同源結構域蛋白TGIF，它作為輔助抑制因子可以和Smad2蛋白相互作用，從而使其活性減低[15]。此外，其他一些調節蛋白與Smad蛋白本身，或者其輔助激活因子相互作用，能夠降低轉錄活性。

3.5 解除抑制和失活 Smad蛋白抑制轉錄可以通過抑制轉錄激活因子的活性來間接實現。Smad蛋白接受TGF信號后，一方面，Smad3蛋白和MyoD的基本螺旋-圈-螺旋（helixloop-helix， bHLH）結構相結合，以防止形成MyoD-E12/47二聚體結合于靶基因E-盒反應元件上，阻止肌源細胞分化；另一方面，通過移除某些靶基因啟動子上的轉錄抑制因子，從而解除對靶基因的抑制作用。Marty T等[23]研究發現，果蠅Dpp信號通路就是通過減低轉錄抑制因子Brinker對靶基因的抑制來完成對一些基因的調節的。

3.6 基因協同表達 Baldessari 等[24]研究發現，在同一組織中，一組基因的表達是協同完成的，尤其是容易出現在胚胎發育過程中，而基因協同表達在生物學上則具有更為重要的意義，有學者認為，這些參與協同反應的基因可能屬于同族基因，因此，能夠對相同因子做出反應，但目前其具體機制尚不清楚。在果蠅研究中發現，TGF家族信號通路中，轉錄復合物需要由輔助因子RSmad-Smad4共同構成，一個BMP4信號協同組由Smad7、bambi和vent2三種基因共同構成，并通過OAZ-Smad1-Smad4復合物和遠處vent2基因啟動子區BRE相結合，共同實現對BMP4誘導調節過程[15]。

3.7 泛素化調節和乙酰化作用 均典型的泛素化調節蛋白是Smad1和Smad2蛋白，受到TGF信號的積累刺激，磷酸化的Smad2與26S蛋白酶體中的磷酸酶迅速發生相互作用。除此之外，依賴泛素的蛋白酶體進行緩慢地脫磷酸作用亦可發生。不同于Smad2蛋白，Smad1蛋白缺少BMP信號后磷酸化后，被依賴于泛素化E3連接酶Smurf破壞。另外一些Smurf家族成員成員具有相似的結構，可以作用于不同于其他信號傳導通路，如哺乳動物Smurf2調節Smad1、Smad2和Smad3，dSmurf調節果蠅胚胎發育。但是，即具備C末端HECT結構域，并有一個N-C2磷脂蛋白和鈣結合結構域是所有Smurf家族成員都存在共同點。Yang Q等[25]研究表明，Smad蛋白泛素化在一定條件下受到乙酰化控制，可通過相同賴氨酸殘基乙酰化阻止Smurf泛素化實現，但該過程不會造成蛋白亞細胞分布的改變。

3.8 抑制性Smad蛋白 Smad6和Smad7為脊椎動物的抑制性Smad蛋白，相比與R-Smad或Smad4，二者的MH2結構域缺少了C末端調節受體磷酸化位點，Smad6主要抑制BMP通路，而Smad7則抑制TGF/激活素和BMP信號通路，過表達Smad6/Smad7均會對TGF和BMP通路起到抑制作用。

Smad6與Smad4競爭結合R-Smad1，可以通過形成Smad1-Smad6復合物抑制Smad1-Smad4活性復合物的形成。Smad6基因敲除的小鼠表現為BMP信號反應增高，尤其是在心血管系統中，這是由于Smad4在這些組織中表達量較多所致的[26-27]。

Smad7能夠直接和R-Smad蛋白競爭，同時具有與TGF和BMP受體結合能力。在果蠅中研究中發現，Smad7對TGF和BMP信號傳導進行調節就是通過該種方式。Smad7除了具有競爭性抑制作用外，還能夠調節TGF和BMP通路中Smurf遍在蛋白連接酶體系對受體的遍在蛋白化作用。Smurf2連接到Smad7蛋白，是通過將Smurf-Smad7輸出到細胞質中，降調節信號傳導，進而調節Smad7的遍在蛋白化和降解Smad[26]。

3.9 信號整合的關鍵 TGF轉錄因子家族通過Smad信號通路調控細胞的增殖、分化、代謝遷移、定位以及凋亡等，它與其他信號通路正確整合調控，對于保證個體功能正常而言顯得尤為重要，Smad蛋白成為信號整合的關鍵。Smad蛋白家族提供了一個整合輸入信號平臺結構，它包含連接區、DNA結合輔助因子以及分子表面與這些因子所連接的部分，在這些結構中，以疏水MH2結構域中的走廊結構為最重要的組成部分[28]。Smad蛋白可以通過上述3種元件與多種信號通路進行連接，并將信號整合傳遞給細胞核內靶基因，實現調控基因表達目的。

綜上所述，隨著不斷深入研究Smad蛋白家族發現，三種不同類型的Smad蛋白之間存在相互協助作用，依賴Smad4和R-Smad組成活性復合物，借助一些輔助因子的幫助，進入細胞核內對靶基因表達予以調控。而抑制性Smad蛋白起到阻止活性復合物形成、確保Smad蛋白功能正常發揮的作用。Smad作為TGF-β通路的胞內信號蛋白，受到多種信號通路的影響，Smad信號通路已成為TGF轉錄因子信號通路中重要的組成部分，既能夠廣泛調節多種基因表達，也能夠在各個不同信號在胞內整合中發揮作用，實現對于細胞核內靶基因功能的共同調節。

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