γ-氨基丁酸能神經元在新生大鼠缺氧性癇性發作中的作用

孫衛文， 詹麗璇， 李 珂， 徐 恩

缺氧是導致新生兒缺氧性腦病和癇性發作的主要原因。新生兒缺氧在臨床上極為常見。相對于正常兒童、新生兒期或圍產期缺氧的患兒成年后對致癇因素的敏感性升高［1］。目前尚未明確新生兒期的缺氧性損害是如何導致成年后癲癇易感性升高的。本研究通過建立新生大鼠缺氧性癇性發作模型，觀察新生大鼠早期發育過程中及缺氧性癇性發作后海馬的組織病理改變，探討原癌基因c-fos與γ-氨基丁酸(γamino butylic acid，GABA)能神經元在新生大鼠缺氧性癇性發作模型中的作用及可能的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生10d的SD大鼠，由中山大學醫學院實驗動物中心提供，置于光照:黑暗=12:12標準光照周期的動物房喂養，母鼠與同窩小鼠同籠飼養，母鼠自由攝食和飲水。所有實驗動物的操作及飼養均符合中華人民共和國實驗動物管理條例。

1.2 動物分組 實驗動物分為對照組(C)和缺氧性癇性發作組(H)。根據不同時間點，對照組又分為:對照1d組(C1d)、對照3d組(C3d)、對照7d組(C7d)、對照14d組(C14d)。缺氧性癇性發作組分為缺氧后1d組(H1d)、缺氧后3d組(H3d)、缺氧后7d組(H7d)、缺氧后14d組(H14d)。每組10只動物。

1.3 主要實驗試劑 混合氣體購自廣州市氣體場，S-P試劑盒購自邁新生物技術開發有限公司;抗GAD抗體購自Stressgen Bioreagents;抗c-fos抗體購自Santa Cruz Biotechnology。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物模型的制備 本研究采用改良的新生大鼠缺氧性癇性發作模型［2］，選取新生10d的Sprague-Dawley(SD)大鼠為實驗對象，在恒溫34℃的缺氧箱內進行缺氧，通入恒溫34℃的含有5%氧氣、95%氮氣的混和氣體，共通氣17min。通氣17min后取出新生鼠，做標記后放入原籠中，與其母鼠一同喂養。

1.4.2 動物模型成功標準 動物在進行缺氧的17min內出現面部痙攣、節律點頭、跌倒等表現。根據經典的Racine標準［3］對動物表現進行分級:0級:無驚厥;1級:面部痙攣;2級:面部痙攣+節律點頭;3級:面部痙攣+節律點頭+前肢陣攣;4級:面部痙攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立;5級:面部痙攣+節律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒。4、5級為全身性驚厥或大發作，為入組標準。舍去標準:明顯體弱，不能自食母乳的新生鼠;缺氧過程中死亡的新生鼠;缺氧過程中表現未達到4級或以上的新生鼠。缺氧后將新生鼠放入置有其同胞新生鼠及母鼠的籠內，注意保暖，注意保持籠內衛生。

1.4.3 腦組織取材 麻醉動物后用4℃生理鹽水100ml經心臟快速灌注沖凈血液，隨后用4℃的4%的多聚甲醛以先快后慢的速度灌注固定。取腦放入4℃的4%的多聚甲醛中進行后固定，并先后放入15%、30%的梯度蔗糖多聚甲醛溶液中脫水，冰凍包埋劑包埋，冰凍切片(片厚40μm)，選取典型海馬區腦片，一部分用于做Nissl染色，光鏡下觀察腦缺氧損傷組織學特點，另一部分做免疫組織化學，觀察GAD和c-fos在不同時間段正常新生大鼠海馬組織的表達及腦缺氧性癇性發作后不同時間段的變化。

1.4.4 Nissl染色 腦片1%焦油紫溶液染色15min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.4.5 免疫組織化學SP法染色 腦片放入裝有0.01mol的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 值 7.4)的多孔板，PBS洗3次各5min，3%H2O2室溫孵30min，消除內源性過氧化物酶的活性，PBS洗3次各5min，加入由PBS稀釋的混合溶液，溶液含第一抗體(GAD 1:800或者c-fos 1:800)、封閉液(2%小牛血清，0.1%Triton)，4℃震蕩孵育過夜。PBS洗3次各5min，滴加含生物素標記的第二抗體，室溫孵育2h。PBS洗3次各5min，滴加含辣根過氧化物酶標記的第三抗體，室溫孵30min。PBS洗3次各5min，DAB顯色液顯色1min。梯度酒精脫水，透明，封片。

1.5 數據采集 對于DAB免疫組化的結果進行陽性細胞計數，每張切片于CA1區選5個高倍鏡視野，分別計數陽性細胞數，取均值進行統計分析。c-fos免疫組化的結果用WCIF Image J系統分析，每只動物均隨機挑選1～2張典型背測海馬切片，低倍鏡下讀取海馬CA1區的灰度值，選取胼胝體作為背景，將背景的灰度值減去CA1區的灰度值進行統計分析。

1.6 統計分析 采用SPSS11.5進行統計分析。多組數據之間計量資料的比較用單因素方差分析(ONE WAY ANOVA)，組間的數據兩兩比較采用Bonferreoni或者Tamhane’s T2檢驗。兩組數據的計量資料用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠海馬各區域Nissl染色結果 對照組及缺氧組大鼠腦組織低倍鏡下海馬各區細胞排列緊密，形態結構正常;高倍鏡下神經元結構完整，細胞內有豐富粗大的尼氏體。缺氧組中海馬各區域細胞結構完整，胞漿內尼氏體無明顯改變，未見細胞死亡。

2.2 大鼠海馬各區域c-fos免疫組織化學反應的結果 對照組和缺氧性癇性發作組的海馬各區均可見棕黃色c-fos蛋白免疫陽性細胞，細胞呈圓形或橢圓形，c-fos主要均勻分布于胞核，胞核著色最深(見表1)。各組c-fos蛋白灰度分析如表1所示。單因素方差分析顯示各對照組海馬CA1區c-fos蛋白灰度值差異無統計學意義(F=0.441，P=0.727);CA3區c-fos蛋白灰度值差異無統計學意義(F=0.477，P=0.703);DG 區域 c-fos 蛋白灰度值差異無統計學意義(F=0.338，P=0.798)。單因素方差分析顯示各缺氧性癇性發作組CA1區c-fos蛋白灰度值差異有非常顯著意義(F=56.21，P＜0.01)，組間比較顯示H7d組c-fos蛋白灰度值明顯高于 H1d組、H3d組和 H14d組 (P＜0.01，P＜0.01，P ＜0.01)，H1d 組、H3d組與 H14d組間 c-fos蛋白灰度差異無統計學差異;CA3區(F=186.91，P＜ ＜0.01)和 DG 區(F=34.39，P ＜ 0.01)結果與CA1區相似，H7d組c-fos蛋白灰度值明顯高于其它時間點組。各缺氧性癇性發作組與對照組海馬CA1區域c-fos蛋白灰度分析的比較，單因素方差分析顯示各缺氧性癇性發作組與各對照組CA1區域c-fos蛋白灰度值差異有非常顯著意義(F=41.91，P＜0.01)。組間比較顯示H7D組的c-fos蛋白灰度值明顯高于C7d組(P＜0.01)，而H1d組與C1d組間(P=0.264)、H3d 組與 C3d 組間(P=0.498)、H14d組與C14d組間(P=0.637)c-fos蛋白灰度差異無統計學意義。CA3區(F=127.9，P ＜0.01)和 DG 區 F=30.62，P ＜0.01)結果與 CA1區相似，缺氧性癇性發作7d組c-fos蛋白灰度值明顯高于對照7d組，其它各組間比較差異無統計學意義。

2.3 大鼠海馬各區域DAB免疫組織化學反應的結果 缺氧性癇性發作組和對照組各海馬分區均可見棕褐色GAD蛋白免疫陽性細胞。GAD蛋白免疫陽性細胞彌散地分布在整個海馬結構。陽性細胞主要密集地排列在CA1～CA3的錐體細胞層和齒狀回的顆粒細胞層，大部分為卵圓形或多邊形，部分神經元的突起清晰可見。陽性細胞在CA1區主要分布在起層(stratum orients，SO)和錐體細胞層(stratum pyramidale，SP)，而在 CA1～CA3區錐體細胞層則可以看到GAD免疫反應陽性的軸突叢，可見有部分神經元的突起貫穿整個錐體細胞層。各組GAD陽性細胞數(見表2)。

表1 各組c-fos蛋白灰度分析的比較(χ±s)

表2 各組GAD陽性細胞數的比較(χ±s)

3 討論

缺氧造成的癲癇樣發作多發生于兒童［4］。圍產期缺氧造成的急性癲癇樣發作能使患兒在發育過程中對癲癇的易感性升高，并能造成患兒長時期的智能受損。故新生鼠缺氧性癲癇模型是人們研究腦缺氧的理想方法之一。Jensen［2］等研究發現缺氧的致癇作用具有明顯的時間依賴性，相對于新生5d鼠或成年鼠(出生后60d)，新生10～12d的大鼠對缺氧特別敏感。新生10～12d大鼠缺氧時的強直陣攣發作、缺氧后對致癇因素的敏感性升高及發育成熟后的智能受損，這些表現均與臨床新生兒缺氧性癲癇癥狀極為相似。本研究采用Jensen改良新生大鼠缺氧性癇性發作模型，在缺氧過程中根據經典的Racine標準對動物表現進行分級。本實驗結果顯示Jensen改良新生大鼠缺氧性癇性發作模型缺氧時強直性陣攣發作表現較一致，重復性好，除極個別大鼠評分未達到4級外，絕大部分大鼠達到4級、5級評分，符合全身性驚厥或大發作的入組標準。

Jensen［2］等用含有 3%O2的混合氣體對新生10d大鼠進行缺氧，并將其在缺氧后75d暴露于致癇劑三氟乙醚，2～3d后取鼠腦進行HE染色，結果顯示未見神經膠質細胞增生，皮層、杏仁核、海馬、齒狀回均正常。Sanchez［5］等 通過原位末端標記法對改良后的新生大鼠缺氧性癇性發作模型進行了形態學觀察，選取缺氧后 12h、24h、48h、72h、96h 和 7d 各個時間點進行觀察，結果顯示，沒有在海馬區域發現受損或瀕死的細胞。本研究顯示新生大鼠缺氧性癇性發作模型未能造成缺氧后即時或缺氧后14d內海馬明顯的細胞死亡，與上述研究結果一致。結果表明，新生大鼠低氧后癇性發作并非由于神經元丟失所致。然而，Garrido［6］在對毛果云香堿誘發的癲癇持續狀態模型的研究中發現癲癇發作一個月后基底前腦中間區和外側區出現明顯萎縮。對于缺氧14d后的時間點海馬區域和其它腦區的組織病理學改變尚需進一步研究證實。

c-fos是神經功能活動的代謝性標志物，屬于即早基因為細胞受刺激后表達的基因。正常情況下，細胞內c-fos的mRNA和c-fos蛋白水平均很低，缺氧、炎癥等損傷性刺激因子可誘導中樞神經系統內c-fos基因的表達。缺氧后大量內流的Ca2+激活cfos基因的轉錄和翻譯。Szyndler［7］等研究發現，戊四唑化學點燃癲癇樣活動能夠使大鼠齒狀回、梨狀皮層細胞核內的c-fos蛋白免疫反應活性快速而短暫地增強。Gass［8］等在用GABA能受體抑制劑荷包牡丹堿(bicuculline)靜脈注射誘發大鼠癲癇發作后，發現c-fos蛋白在海馬區表達迅速增高，2h達高峰，8h恢復至基礎水平，其表達主要位于齒狀回顆粒細胞層。以上研究證明，當神經元受刺激后，c-fos的表達快速出現，迅速達到高峰，維持較短時間后又回到基礎穩定水平。但也有學者持不同的意見，Liang等［9］在破傷風毒素(tetanus toxin，TT)所致 SD 大鼠癲癇模型中發現，同為IEGs的Zif/268蛋白質在TT注射5～7d后出現表達增強，持續14d。有學者提出c-fos的表達至少存在3種模式:(1)快速一過性表達;(2)延遲持續性表達;(3)持續的組織特異性表達［10］。本研究結果顯示缺氧7d后c-fos蛋白含量在海馬各區的表達明顯增加，表明缺氧性癇性發作后存在c-fos的延遲性表達，其表達的增加可能起始于缺氧后4～7d，到缺氧后14d時已降低到基礎水平。Taniguchi［11］等的研究表明缺氧后即出現c-fos表達的增高，3h后降到對照組水平，1d后出現c-fos的第二次增高，7d時到達最高值，與本實驗結果一致。cfos本身的變化不可能在各種刺激發生后出現持久的功能和行為改變中起重要作用，但是c-fos的表達產物可以與目標基因的起動子區域相結合，作為轉錄因子來調節這些基因的表達，從而對細胞的結構、功能產生長期影響。本研究中缺氧后7d c-fos表達的增高是否與缺氧性腦病癇性發作后神經元的損傷與修復有關將有待進一步研究探討。

GABA是哺乳動物中樞神經系統中起主要作用的抑制性神經遞質，GAD表達異?？梢餑ABA的水平的異常。有研究顯示海馬區域的GAD蛋白最早出現在胚胎發育的第17～18天，胚胎期GAD mRNA水平與成年期相比存在明顯的差異［12］。Seress［13］等的研究發現海馬區GAD陽性神經元的增加在發育過程中存在兩個高峰，第一個高峰是在出生后4～8d;第二個高峰是在出生后12～16d。本研究結果顯示GAD蛋白的含量隨著發育的進行呈進行性增高的趨勢，且出生后13d左右升高最明顯，提示起始于海馬發育早期的GABA能神經元在大鼠出生初期并未成熟，而是隨個體的發育數量逐漸增加、功能漸趨完善。

多年來，學者們一直認為中樞神經系統內GABA能神經元抑制作用減弱或缺乏是導致興奮性毒性損害發生的重要原因之一。然而近年來的研究卻發現在新生兒發育過程中存在著Cl-從神經元細胞內向細胞外轉移現象［14］，中樞神經系統神經元內的低Cl-濃度狀態是由神經系統發育初期的高Cl-濃度狀態轉變而來，而抑制性GABA能神經元在胚胎發育初期則發揮興奮性神經元的作用［15］。關于GABA能神經元功能轉變時間，大部分學者認為在新生后2w左右［16］。本研究選用新生10d大鼠制作模型，此期間GABA應是起興奮性毒性損害作用，然而本研究的結果卻顯示缺氧后3d內GAD表達與對照組相比無明顯改變，提示GABA能神經元在新生大鼠缺氧性癇性發作后早期并沒有發揮明顯的興奮性損害或抑制性保護作用。Koh［17］的研究發現缺氧對新生10d大鼠造成的急性和慢性作用均能被谷氨酸AMPA受體抑制劑所阻滯。Azimi-Zonooz等［18］研究發現新生7～13d大鼠海馬區域Ca2+內流主要是由谷氨酸能神經元激活導致的，而GABA能神經元的激活對Ca2+內流的影響作用卻甚微。由此我們推測在新生大鼠缺氧性癇性發作早期中發揮主要作用的神經元仍是傳統意義上的興奮性神經元-谷氨酸能神經元。

本研究結果顯示在海馬的CA1區、CA3區以及DG區，缺氧后7～14d GABA能神經元的含量減少，提示缺氧性癇性發作后在海馬的CA1區、CA3區以及DG區存在著GABA能神經元的損傷過程。目前已有多種癲癇模型顯示有GABA能神經元的丟失。Freichel［19］等發現在紅藻氨酸或毛果云香堿誘發的癲癇發作后，大鼠梨狀皮質 GAD含量降低。Thind［20］等發現在毛果云香堿誘導的癲癇模型中大鼠海馬齒狀回區出現GABA能神經元早期即出現的丟失。Guo［21］等在對毛果云香堿誘發的癲癇模型研究中，也發現在癲癇發作后海馬齒狀回區出現了含GAD(67)mRNA的神經元的大量丟失。本研究中GABA能神經元的丟失是否與成年后癲癇易感性升高有關尚需進一步研究證實。目前尚不清楚GABA能神經元在癲癇模型中丟失的機制，但已有研究發現在癲癇模型中出現含有鈣結合蛋白的神經元的大范圍丟失［22］。目前國內外學者普遍認為短暫快速的Ca2+內流和緩慢的Ca2+內流引起的細胞去極化是導致這種自發性放電的重要原因之一，當去極化達到一定程度時，就會爆發一系列迅速的去極化過程。鈣結合蛋白是一類能與Ca2+結合的蛋白質，存在于包括神經元在內的多種細胞，鈣結合蛋白可以保護神經元免遭由于電壓依賴性鈣濃度過高引起的損害，而含鈣結合蛋白的神經元則能夠對癲癇發作中的細胞內Ca2+超載起到一定的緩沖保護作用。Magloczky［23］等對10例顳葉癲癇患者的顳葉切片研究中發現4名患者的齒狀回顆粒細胞鈣結合蛋白的丟失率超過90%，4名患者的齒狀回顆粒細胞鈣結合蛋白的丟失率超過50%，2名患者的丟失率為20%。有學者推測由鈣結合蛋白的功能受損發展到GABA能中間神經元的丟失是癲癇的主要病理過程。本研究未涉及缺氧性癇性發作模型中GABA能神經元丟失的具體機制，其是否與鈣結合蛋白的損傷有關有待進一步研究探討。

本研究的結果顯示，缺氧性癇性發作后14d內并沒有造成大鼠海馬區即時或遲發性細胞丟失，但c-fos表達在大鼠海馬區有遲發性增高;缺氧性癇性發作后海馬GABA神經元數量的減少可能是新生大鼠缺氧誘導癇性發作后癲癇易感性升高的原因之一。

［1］Jensen FE，Wang C，Stafstrom CE，et al.Acute and chronic increases in excitability in rat hippocampal slices after perinatal hypoxia in vivo［J］.JNeurophysiol，1998，79(1):73-81.

［2］Jensen FE，Applegate CD，Holtzman D，et al.Epileptogenic effects of hypoxia on immature rodent brain［J］.Ann Neurol，1991，29:629-637.

［3］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation II Motor seizure［J］.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32:281-294.

［4］Sankar MJ，Agarwal R，Aggarwal R，et al.Seizures in the newborn［J］.Indian J Pediatr，2008，75(2):149-155.

［5］Sanchez RM，Koh S，Rio C，et al.Decreased glutamate receptor 2 expression and enhanced epileptogenesis in immature rat hippocampus after perinatal hypoxia-induced seizures［J］.J Neurosci，2001，21(20):8154-8163.

［6］Garrido Sanabria ER，Castaoeda MT，Banuelos C，et al.Septal GABAergic neurons are selectively vulnerable to pilocarpine-induced status epilepticus and chronic spontaneous seizures［J］.Neuroscience，2006，142(3):871-883.

［7］Szyndler J，Maciejak P，Turzynska D，et al.Mapping of c-Fos expression in the rat brain during the evolution of pentylenetetrazol-kindledseizures［J］.Epilepsy Behav，2009，16(2):216-224.

［8］Gass P，Herdegen T，Bravo R，et al.Induction of immediate early gene encoded proteins in the rat hippocampus after bicuculline-induced seizures:differential expression of KROX-24，Fos and Jun proteins［J］.Neuroscience，1992，48(2):315-324.

［9］Liang F，Jones EG.Zif268 and Fos-like immunoreactivity in tetanus toxin-induced epilepsy:reciprocal changes in the epileptic focus and the surround［J］.Brain Res，1997，19:281-292.

［10］Curran T，Morgan JI.Fos:an immediate-early transcription factor in neurons［J］.J Neurobiol，1995，26(3):403-412.

［11］Taniguchi T，Fukunaga R，Matsuoka Y，et al.Delayed expression of c-fos protein in rat hippocampus and cerebral cortex following transient in vivo exposure to hypoxia［J］.Brain Res，1994，21:119-125.

［12］Popp A，Urbach A，Witte OW，Frahm C.Adult and embryonic GAD transcripts are spatiotemporally regulated during postnatal development in the rat brain［J］.PLoSOne，2009，4(2):e4371.

［13］Seress L，Ribak CE.The development of GABAergic neurons in the rat hippocampal formation.An immunocytochemical study［J］.Brain Res Dev Brain Res，1988，44:197-209.

［14］Stein V，Hermans-Borqmever I，Jentschm TJ，et al.Expression of the KCl cortransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride［J］.J Comp Neurol，2004，468(1):57-64.

［15］Herlenius E，Laqercrantz H.Development of neurotransmitter systems during critical periods［J］.Exp Neurol，2004，190:S8-21.

［16］Rivera C，Voipio J，Kaila K.Two developmental switches in GABAergic signalling:the K+-Cl-cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII［J］.J Physiol，2005，562(1):27-36.

［17］Koh S，Tibayan FD，Simpson JN，et al.NBQX or topiramate treatment after perinatal hypoxia-induced seizures prevents later increases in seizure-induced neuronal injury［J］.Epilepsia，2004，45(6):569-575.

［18］Azimi-Zonooz A，Shuttleworth CW，Connor JA.GABAergic protection of hippocampal pyramidal neurons against glutamate insult:deficit in young animals compared to adults［J］.JNeurophysiol，2006，96(1):299-308.

［19］Freichel C，Potschka H，Ebert U，et al.Acute changes in the neuronal expression of GABA and glutamate decarboxylase isoforms in the rat piriform cortex following status epilepticus［J］.Neuroscience，2006，15:141(4):2177-2194.

［20］Thind KK，Yamawaki R，Phanwar I，et al.Initial loss but later excess of GABAergic synapses with dentate granule cells in a rat model of temporal lobe epilepsy［J］.JComp Neurol，2010，518(5):647-667.

［21］Guo J，Liu J，Fu W，et al.The effect of electroacupuncture on spontaneous recurrent seizure and expression of GAD(67)mRNA in dentate gyrus in a rat model of epilepsy［J］.Brain Res，2008，10(1188):165-172.

［22］Silva AV，Regondi MC，Cipelletti B，et al.Neocortical and hippocampal changes after multiple pilocarpine-induced status epilepticus in rats［J］.Epilepsia，2005，46:636-642.

［23］Magloczky Z，Wirtner L，Borhegyi Z，et al.Changes in the distribution and connectivity of interneurons in the epileptic human dentate gyrus［J］.Neuroscience，2000，96:7-25.