IL-1β通過NF-κB促進大鼠內側顳葉癲癇慢性進展

甘 娜， 孔惠敏， 馬玉平， 彭 鏡， 吳麗文， 尹 飛

內側顳葉癲癇(mesial temporal lobe epilepsy，MTLE)是指源于海馬、杏仁核、海馬旁回的局部癲癇性發作，是最常見的難治性癲癇之一，早期有效的治療對預后的改善十分重要。神經元丟失、軸突出芽和突觸重建是MTLE慢性期的主要病理改變，也是導致MTLE慢性發作及難治的病理基礎，但其形成的機制至今仍未完全闡明。

近年來越來越多的研究顯示，炎癥反應及炎癥因子參與了癲癇的發生發展過程，如在癲癇患者手術切除的海馬組織中，星形膠質細胞活化、白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及其受體表達增高，炎癥細胞浸潤增多［1，2］。而白介素作為最早被發現的炎癥因子，在風濕、免疫、創傷等領域均有了廣泛和深入研究，但目前關于IL-1β與MTLE的發生發展的關系研究甚少。核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是急性炎癥轉錄因子及神經元興奮性和膠質瘢痕形成的參與因子，有研究顯示［3］海馬硬化患者海馬中NF-κB表達顯著增加，而MTLE病理進展中NF-κB的高表達是否與IL-1β相關少見報道。本文就IL-1β與NF-κB在MTLE的作用及相互關系開展初步觀察研究，以期為MTLE的早期診斷治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型制備及分組 21日齡SD大鼠腹腔注射氯化鋰(127mg/kg，美國Sigma)并隨機分生理鹽水對照組(對照組)、匹羅卡品誘導模型組(模型Ⅰ組)、匹羅卡品誘導及IL-1β干預組(模型Ⅱ組)。模型Ⅰ組和模型Ⅱ組于注射氯化鋰17～18h后腹腔注射匹羅卡品(50mg/kg，美國Sigma)誘導出現癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)。模型Ⅱ組在 SE誘發成功0.5h后側腦室注射 IL-1β 10ng/kg;對照組予等量生理鹽水代替匹羅卡品腹腔注射。匹羅卡品誘發癲癇時，達到Lado幼鼠癲癇發作分級標準5～7級并持續2h或瀕危時腹腔注射水合氯醛(300mg/kg)終止發作。于8w(慢性期)后取鼠腦行后續試驗。

1.2 行為學觀察 急性期誘導SE發作后每天逐只觀察存活鼠有無反復自發癇性發作(spontaneous recurrent seizures，SRS)以及 SRS 發作頻率、強度及持續時間，直至致癇后第8周大鼠SRS基本穩定為止，出現SRS即為慢性癲癇幼鼠模型制作成功，模型組中未出現SRS者從模型組剔除。

1.3 腦電圖檢測 模型鼠進入慢性期后，麻醉并進行電極包埋，術后單籠飼養1w，隨后進行腦電監測。每日記錄腦電12h，連續1w。電極包埋坐標為:正中線左2mm，前囟后3.5mm，深2.5mm。

1.4 尼氏染色 選取經海馬DG區、CA1區、CA3區的冠狀切片，浸入0.1%焦油紫染液中染色10min，分色(鏡下掌握時間)，流水沖洗后，梯度酒精脫水，二甲苯透明兩次，各10min;中性樹膠封片。鏡下觀察海馬DG區、CA1區、CA3區神經元丟失程度。計數各組海馬各區神經元數目情況。

1.5 Timm染色 選經海馬DG區、CA3區的冠狀切片，經梯度酒精脫水后，浸入新鮮配制的Timm孵育液。Timm孵育液配方:(1)50%阿拉伯樹膠60ml;(2)檸檬酸鹽緩沖液(檸檬酸鈉2.35g加檸檬酸2.55g溶于10ml蒸餾水);(3)對苯二酚溶液(1.7g對苯二酚溶于30ml蒸餾水);(4)17%硝酸銀溶液1.5ml。暗室內新鮮配制。常溫下孵育60～90min，傾去孵育液，取出載玻片，流水沖冼 5～10min終止反應，常規脫水、透明，中性樹膠封片。光鏡下齒狀回顆粒細胞及CA3區錐體細胞層苔蘚纖維終末因富含Zn2+，能被Timm硫化銀染色方法特異性染色，顯示為棕黃或黑色顆粒。根據MFS評分標準進行評分。

1.6 EMSA檢測NF-κB蛋白在海馬中的表達

取各組實驗鼠新鮮海馬組織提取核蛋白，以3μg蛋白量上樣，分別加入5×EMSA/Gel-shift結合緩沖液 2μl、生物素標記的 NF-κB 探針1μl，用去 DNA 酶水定容至10μl，室溫靜置20min后，加入10×EMSA/Gel-shift上樣緩沖液1μl，混勻后立即上樣。用0.5 ×TBE 液，150V，電泳 60min。0.5 ×TBE 液，100V，正電荷尼龍膜轉膜60min。再于紫外燈下10cm處交聯10min，然后將膜封閉、洗滌、平衡后，ECL發光顯影。

1.7 免疫組化檢測NF-κB p65蛋白在海馬中的分布與表達 取5μm厚的完整海馬石蠟切片，經常規脫蠟水化，3%H2O2作用10min，微波熱修復，加入一抗(NF-κB p65，1:500;購于 Abcam 公司)4℃孵育過夜。取出后0.1mol/L PBS清洗3次，每次5min，然后參照二步法免疫組化檢測試劑盒(北京中杉PV-9000)說明書操作，加入聚合物輔助劑(試劑1)37℃作用30min。0.1mol/L PBS洗5min×3次后，與辣根酶標記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體(試劑2)37℃作用30min，PBS浸洗5min×3次。DAB染色10min，流水充分沖洗，蘇木素染核。常規脫水透明封片。于顯微鏡下計數陽性細胞率。

1.8 統計學處理 數據資料以均數±標準差(χ±s)表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，兩組均數比較采用t檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗。用SPSS13.0軟件進行統計分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學觀察 模型Ⅰ組達SE并存活的模型大鼠共25只，模型Ⅱ組32只，在急性期模型Ⅰ組和模型Ⅱ組大鼠均有進食進水減少、體重增長減緩、激惹、攻擊性增強等表現，并間歇出現驚厥發作，持續數秒至1min不等，但模型Ⅱ組較模型Ⅰ組更加明顯。模型Ⅰ組大鼠上述癥狀于致癇后3～5d逐漸消失;而模型Ⅱ組持續到致癇后5～7d。致癇后第3周左右陸續有模型大鼠開始出現自發癇性發作，表現為機械性點頭、咀嚼、前肢陣攣、直立等，可出現全身強直陣攣等大發作，但發作時間不長，每次發作持續約數10s～2min不等，可自行終止，發作頻繁者1d發作數次，聲光刺激有時可誘發發作。至致癇后第8周自發發作基本穩定，此時模型Ⅰ組和模型Ⅱ組致SE并存活模型大鼠分別為21只和22只，其中分別有13只和16只出現自發癇性發作，即急性期匹羅卡品誘導SE后存活并發展成為成年期慢性顳葉癲癇的比例為62.9%和72.7%，死亡率為19.4%和31.2%。生理鹽水對照組及急性期未達SE的模型組大鼠均未見自發癇性發作(見表1)。

2.2 EEG監測模型鼠海馬異常放電 對照組呈現波幅、節律基本正常的EEG;模型Ⅰ組和模型Ⅱ組均記錄到腦電圖出現典型尖棘波、棘慢波發放，波幅明顯增高。

2.3 尼氏染色觀察海馬區神經元丟失 模型Ⅰ組和模型Ⅱ組各區均見大量神經元脫失，出現空泡樣變性，核固縮;細胞形態不完整、細胞排列松散、紊亂，有較多間隙。于高倍鏡下計數神經元個數，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05);模型Ⅰ組與模型Ⅱ組比較有顯著性差異(P＜0.05)。各組海馬各區神經元數目情況(見表2)。

2.4 Timm染色觀察神經元苔蘚樣出芽 對照組大鼠DG區及CA3區苔蘚纖維層有密集濃染的黑色顆粒，偶爾或極少見到有苔蘚纖維穿越齒狀回顆粒細胞層到達內分子層;模型Ⅰ組和模型Ⅱ組可見較多連續分布的Timm顆粒，與對照組相比均有顯著差異(P＜0.05)。模型Ⅰ組和模型Ⅱ組比較有顯著差異(P ＜0.05)(見表3)。

2.5 EMSA檢測模型鼠海馬內NF-κB的表達

NF-κB在模型Ⅰ組海馬內表達增加，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05);模型Ⅱ組中NF-κB的表達增加，與對照組比和模型Ⅰ組比較均有顯著性差異(P ＜0.05)。

2.6 IHC觀察模型鼠海馬內NF-κB p65的表達 對照組少見 NF-κB p65表達強陽性細胞，且NF-κB p65在細胞核內少有表達。模型Ⅰ組內NF-κB p65表達增加，且陽性細胞較集中分布，可見NF-κB p65由胞漿向細胞核內轉移;模型Ⅱ組中NF-κB p65的表達增加和核內轉移更為明顯。于高倍鏡下計數陽性細胞數并計算陽性率，模型Ⅰ組和模型Ⅱ組與對照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，模型Ⅰ組與模型Ⅱ組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各組模型鼠癲癇發作及死亡情況

表2 各模型組與對照組海馬各區神經元數目(χ±s)

表3 對照組與模型組海馬DG區內分子層MFS評分(χ±s)

3 討論

作為最常見的癲癇亞型，MTLE被認為是因高熱驚厥、癲癇持續狀態、腦炎、腫瘤、外傷等引發的繼發性功能改變所致，并且存在5～10年甚至更長的潛伏期，繼而形成慢性自發癲癇［4］，目前對于該病的治療主要還是通過藥物或其他生物方法控制癲癇的發作，以減少驚厥給大腦造成的損害，而針對病因的治療甚少，這主要是由于該病作用機制尚不明了。

炎癥是最常見且重要的基本病理過程，早前觀點認為由于血腦屏障的存在，大腦成為了免疫豁免場所，炎癥反應是不參與癲癇發生發展的，但是近年來越來越多的研究發現，炎癥反應在癲癇的發生發展中起了重要的作用［5］。而作為前炎癥因子的IL-1β被認為與癲癇的發生有密切的相關性。有報道IL-1β途徑參與了癲癇的發病過程［6］，IL-1β甚至被認為是熱性驚厥致顳葉癲癇海馬硬化的啟動因子［7］。Zheng等［8］亦報道小膠質細胞能通過分泌IL-1β促進海馬神經元的活化。我們早先的研究［9］也發現，在匹羅卡品致癇的MTLE模型中，模型鼠海馬內的IL-1β在急性期和慢性期表達增加。這都提示IL-1β可能對癲癇的發生發展起促進作用。但也有報道認為IL-1β在對神經發生存在負性調控，如IL-1β可以抑制神經發生并減少驚厥所致的神經變性［10，11］;而腹腔或側腦室注射小劑量的 IL-1β 似乎能起到抗癲癇的作用［12，13］。由此可見IL-1β在癲癇病理過程中的作用機制復雜，正性及負性的調控均存在于病理過程之中。本實驗中我們觀察到，大鼠致癇后再注射IL-1β可以加重實驗鼠在急性期的癇性發作，模型Ⅱ組大鼠較模型Ⅰ組表現得更為焦躁、攻擊性強，并且這種狀態持續時間以及急性期反復的驚厥發作次數均較模型Ⅰ組明顯。進入慢性癲癇自發發作期后，模型Ⅱ組的癲癇自發發生率較模型Ⅰ組高(P＞0.05)，腦電圖改變更加明顯，這說明IL-1β可以加劇模型鼠的癇性發作，并促進慢性期MTLE模型的發病。進一步利用Nissl染色和Timm染色觀察到，模型Ⅱ組神經元脫失和苔蘚樣出芽均較模型Ⅰ組改變明顯，這提示，IL-1β在促進模型鼠自發癲癇的過程中伴隨有大量海馬神經元的死亡，并且導致了Mossy纖維的大量增生，這正是神經元異常放電和癲癇慢性自發發作的病理基礎。

NF-κB體系主要涉及機體防御反應、組織損傷和應激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞，是免疫反應及炎癥應答的關鍵調節因子。NF-κB在細胞內受到多種物質調控，如IL-1β、TNF-α、IL-2等，而NF-κB活化后，亦可增強前述各物質的基因轉錄，使其釋放增多，從而導致炎癥信號的進一步放大。此外在癲癇的神經病理發作過程中，亦觀察到NF-κB起著重要調節作用。諸多研究發現NF-κB在驚厥發作及癲癇慢性自發發作過程中均表達增加［3］，而向癲癇模型鼠體內注射NF-κB抑制劑PDTC可以減少模型鼠的驚厥發作［14］，這提示 NF-κB可能是MTLE發生中的關鍵通路之一。實驗中，我們也證實模型Ⅰ組海馬內NF-κB表達增加，并且觀察到最具代表性的活性亞基NF-κB p65出現明顯的核內轉移，這說明NF-κB可能是匹羅卡品誘導的MTLE的疾病發生和進展的重要環節。既然NF-κB與炎癥和癲癇病理均存在著密切關系，那么NF-κB是否能夠作為一個契合點在炎癥與癲癇的發生過程中起到橋梁的作用呢?目前關于神經系統病變中IL-1β與 NF-κB的關系研究存在不同報道，有研究［15］認為 IL-1β 作為 NF-κB 的上游炎癥因子，通過IL-1RI調節NF-κB的核轉錄，進而影響神經發生、促進炎癥反應、導致星形膠質細胞功能障礙等。Pitkanen［16］等亦報道 IL-1β 通過激活 MAPK 及 NF-κB依賴途徑對癲癇病理過程進行分子改變、離子通道等的調節。同樣也有研究認為［17］TNF-α、IL-1β、GMCSF等的調節均通過NF-κB途徑。而我們通過向致癇模型海馬內注射IL-1β可以觀察到，模型Ⅱ組大鼠海馬內NF-κB的表達較模型Ⅰ組更加明顯，結合行為學觀察以及神經元改變程度，我們有理由認為IL-1β可以通過活化NF-κB并增加其表達，進而促進MTLE大鼠模型慢性期的癲癇自發發作。

綜上所述，增加海馬內IL-1β的表達，可以使匹羅卡品誘導的MTLE模型鼠海馬癲癇慢性自發發作率增加，這可能與IL-1β通過促進NF-κB活化和表達，從而促進神經元脫失和Mossy纖維增生，最終導致神經元異常放電和癲癇慢性自發有關。而炎癥與癲癇病理、IL-1β與NF-κB在此過程中的相關性還有待進一步的動物模型及體外研究，對這一問題的深入研究，可能為MTLE的防治提供新的思路。

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