正交試驗優(yōu)選黃芪有效成分的提取工藝*

牟稷征 崔翰明 盧賀起

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌之功效，臨床應(yīng)用廣泛，為常用補氣中藥，其有效成分具有明確的藥效作用等[1-2]。按中國藥典2010年版一部規(guī)定的質(zhì)量考察標(biāo)準(zhǔn)，需進(jìn)行主要指標(biāo)成分：黃芪甲苷，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定[3]。但相關(guān)測定研究方法仍存在一些不足[4]。同時研究提高不同黃芪有效成分提取率的方法也在不斷開展，如纖維素酶提取法、微波提取工藝法、超微粉碎提取方法等[5-7]。在本項實驗研究中筆者采用了正交試驗法進(jìn)行了相關(guān)研究并取得一定的研究結(jié)果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料

1.1 儀器 Aglient 1200 HPLC-DAD液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；sartorius OSA-22電子分析天平；DZKW-4型電熱恒溫水浴鍋等。

1.2 藥材及試劑 黃芪，購自北京，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，經(jīng)鑒定為規(guī)定品種的中藥飲片，符合中國藥典2010年版一部規(guī)定[3]。黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110781-200613），毛蕊異黃酮葡萄糖苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：101030-200510）；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪甲苷的含量測定 色譜條件：色譜柱Aglient TCC18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；Ser#USJBB01065；流動相：乙腈-水（32：68）；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；蒸發(fā)光散射：溫度105 ℃，氣流量2.8 L/min，空氣泵壓力0.5 mPa（0.45～0.56 mPa），柱壓 75～77 bar，進(jìn)樣量：10 μl。

對照品溶液的制備：精密稱取10 mg黃芪甲苷對照品，用甲醇將其溶解，并定容到25 ml，即得。供試品溶液的制備：精密稱取黃芪4 g（粉碎，過40目篩），置索氏提取器中，加甲醇40 ml，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h，提取液回收溶劑至干，殘渣加水10 ml，微熱溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解定容到10 ml，進(jìn)樣測定。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定 色譜條件：色譜柱：Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；Ser#USJBB01065；流動相：乙腈-0.2%甲酸梯度洗脫，見表1；流速1 ml/min；檢測波長260 nm。

表1 流動相梯度洗脫條件

對照品溶液的制備：精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷5 mg，用甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，即可。供試品溶液的制備：精密稱取黃芪粉末1 g，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流4 h，放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣測定。

2.3 正交試驗優(yōu)選提取工藝

2.3.1 單因素考察溶劑對提取工藝的影響 提取一：取黃芪500 g，用10倍量60%乙醇回流提取1 h，提取1次，醇提液濃縮至約1100 ml，噴霧干燥，得粉末85.2 g。提取二：取黃芪500 g，用10倍量80%乙醇回流提取1 h，提取1次，醇提液濃縮至約680 ml，噴霧干燥，得粉末62.8 g。

黃芪甲苷的測定：供試液的制備：取1 g黃芪醇提物粉末，加水10 ml加熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 ml，棄去氨液，蒸干正丁醇層，殘渣加甲醇定容到5 ml。HPLC測定法同前，黃芪甲苷含量見表2。

表2 黃芪甲苷測定數(shù)據(jù)

結(jié)果顯示，乙醇醇度對黃芪中皂苷的提取影響較大，采用80%乙醇提取時，黃芪皂苷的提取效果最佳，故應(yīng)采用80%乙醇條件提取黃芪。

2.3.2 因素水平的選擇 根據(jù)預(yù)試驗，及對提取液中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的初步含量分析，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)醇度（A）、乙醇溶劑用量（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，采用四因素三水平[L9（34）]正交試驗法確定最優(yōu)提取工藝，因素與水平考察見表3。

表3 黃芪有效成分提取工藝因素、水平考察內(nèi)容

2.3.3 測定與結(jié)果 取黃芪粉碎藥材5.0 g，共9份，參照上述項下方法制備供試品溶液，按設(shè)定方案進(jìn)行提取，再照上述色譜條件測定供試品中的2種成分。

根據(jù)峰面積對正交試驗結(jié)果進(jìn)行分析，具體結(jié)果見表4、表5。

3 討論

3.1 正交試驗法原理是研究密切相關(guān)體中不同水平或同一水平不同因素相互影響程度的一種具有堅實數(shù)學(xué)理論基礎(chǔ)的研究方法，可應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域[8]。目前在中藥藥材有效成分提取工藝的優(yōu)化、中成藥制劑制備工藝的合理性研究方面，該研究方法已成為公認(rèn)、可靠的有效研究手段，相關(guān)研究報道很多[9-10]，進(jìn)一步增強了本項研究結(jié)果的科學(xué)性。

3.2 通過對實驗結(jié)果的分析，完全達(dá)到了試驗的預(yù)期目的。單因素試驗結(jié)果顯示，80%乙醇提取效果較好。正交試驗分析結(jié)果表明，黃芪甲苷提取工藝的影響因素依次為提取次數(shù)>乙醇醇度>提取時間>溶劑用量，采用80%乙醇回流提取2次，每次用量10倍量，時間為1 h；毛蕊異黃酮葡萄糖苷的影響因素依次為提取次數(shù)>溶劑用量>乙醇醇度>提取時間，采用8倍量70%乙醇回流提取3次，提取時間為1.5 h；兩次正交試驗結(jié)果均顯示提取時間影響因素較大。這與目前所發(fā)表的某些研究結(jié)果相一致[11-12]。證明黃芪有效成分黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取的最佳工藝為80%乙醇回流提取2次，每次1 h，溶劑用量為10倍量。

表4 黃芪提取工藝考察（黃芪甲苷）直觀分析

表5 黃芪提取工藝考察（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）直觀分析

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