兔肝VX2瘤模型的建立及其3.0 T磁共振表現(xiàn)

牟曉慶 陳孝均 唐光才 陸笑非

兔肝VX2瘤因與人類原發(fā)性肝癌具有相似的血供特征、侵襲方式及淋巴道、血道轉(zhuǎn)移特點，已成為肝癌基礎(chǔ)研究中最常用的模型之一。本研究探討兔肝VX2瘤模型的建立方法，并在建模后的不同時期分別對其行3.0 T MR常規(guī)序列及DWI檢查，以病理結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”評價VX2瘤的生長特性，從而探尋一種更為經(jīng)濟(jì)、實用的肝癌影像檢查方法。

1 材料與方法

1.1 材料 新西蘭大白兔23只（由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供），雄性15只，雌性8只，體重2.0～3.0 kg。荷瘤兔1只，3%戊巴比妥鈉，8%硫化鈉，外科無菌手術(shù)包，顯微剪，PHILIPS 3.0 T-Achieva/intera雙梯度超導(dǎo)高場強磁共振掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)相控陣線圈。

1.2 兔VX2肝癌動物模型的制作方法

1.2.1 瘤株提取 經(jīng)耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉1 ml/kg，麻醉荷瘤兔后，在無菌條件下剝離腫瘤，切取靠近包膜的灰白色魚肉樣腫瘤組織，注意剔除壞死組織及纖維組織，用顯微剪將腫瘤組織剪碎成1 mm3左右大小的瘤塊，置于盛有生理鹽水的無菌彎盤中備用。

1.2.2 種植過程 實驗兔全麻（用藥及劑量同前），仰臥固定于動物手術(shù)臺上，手術(shù)野常規(guī)剪毛，8%硫化鈉脫毛，按外科無菌操作程序消毒手術(shù)區(qū)皮膚，鋪無菌手術(shù)洞巾。于劍突下約1 cm處沿腹白線作一長約3 cm的上腹正中切口，逐層切開腹壁，暴露肝臟左葉；用食指及拇指輕柔固定肝臟，于其組織較厚處，以顯微剪作一長約3 mm的小切口，經(jīng)切口在肝內(nèi)潛行分離形成一個約3 mm×5 mm大小的腔隙，將備用的1～2個瘤塊植入其中，明膠海綿封閉肝臟切口并按壓止血，待無活動性出血后，1號絲線逐層縫合腹壁切口，關(guān)閉腹腔。

1.2.3 術(shù)后處理 待實驗兔復(fù)蘇后送回動物房中繼續(xù)飼養(yǎng)，注意保持動物房的干燥、通風(fēng)。術(shù)后3 d常規(guī)肌注青霉素40萬U及慶大霉素4萬U，預(yù)防切口感染。

1.3 MR掃描方法及參數(shù) 采用PHILIPS 3.0T-Achieva/intera雙梯度超導(dǎo)高場強MR掃描儀，8通道膝關(guān)節(jié)相控陣線圈。實驗兔檢查前禁食、禁水12 h以上，全麻后（用藥及劑量同前）俯臥固定于8通道膝關(guān)節(jié)相控陣線圈內(nèi)，先行常規(guī)T1WI、T2WI橫斷掃描，再行DWI掃描。具體掃描參數(shù)如下：T1WI（TR 10 ms，TE 2.5 ms，F(xiàn)OV 145×106 mm，NSA 6，層厚3 mm，層間距1 mm，矩陣256×256）；T2WI（TR 3000 ms，TE 80 ms，F(xiàn)OV 145×106 mm，NSA 4，層厚3 mm，層間距 1 mm，矩陣 256×256）。DWI（TR 6000 ms，TE 47 ms，層厚2 mm，間距0.6 mm，各向同性，NSA 6次平均，F(xiàn)OV 185×185 mm，矩陣128×128；梯度因子b值取600 s/mm2），以上各序列掃描范圍均為膈頂至肝臟下緣。

1.4 病理檢查 MR掃描完畢后立即采用空氣栓塞法處死實驗兔，取肝臟原發(fā)腫瘤及周圍正常肝組織，采用10%中性甲醛溶液固定，48 h后行石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 種植結(jié)果 23只實驗兔中，1只術(shù)前麻醉過度死亡，3只在種植后第6、10、12天腹瀉死亡，1只吞食金屬異物未能完成檢查，2只在植瘤后14 d行MR常規(guī)掃描時發(fā)現(xiàn)植瘤失敗的實驗兔均被剔除出實驗，其余16只建模成功，成瘤率70%。

2.2 3.0T MR檢查結(jié)果 將成功建模的16只實驗兔依照兔肝VX2瘤的一般分期隨機分為3組（即14 d組6只、28 d組6只及42 d組4只），在對應(yīng)的時間內(nèi)行MR檢查。14 d組瘤體最大徑約0.5 cm，3.0T MR常規(guī)序列及DWI檢出7個肝內(nèi)病灶，其中5只1個病灶，1只2個病灶；28 d組瘤體最大徑約2.5 cm，3.0 T MR常規(guī)序列及DWI檢出9個肝內(nèi)病灶，其中4只1個病灶，1只2個病灶，1只3個病灶。42 d組瘤體最大徑約5.0 cm，3.0T MR常規(guī)序列及DWI發(fā)現(xiàn)4個肝內(nèi)病灶及廣泛的肝內(nèi)小轉(zhuǎn)移灶。14 d組的VX2瘤體積較小，以28 d組與42 d組瘤體顯示更為清晰。

MRI常規(guī)序列圖像上，14 d組VX2瘤在T1WI均呈稍低信號，在T2WI呈均勻稍高信號；28 d組與42 d組VX2瘤在T1WI 均呈稍低信號、部分在T2WI呈不均勻稍高信號（圖1A、B）。DWI圖像上，所有VX2瘤均呈明顯高信號，與周圍正常肝組織對比鮮明；28 d組與42 d組的VX2瘤中心可見斑片狀低信號（圖1C）。

2.3 病理檢查結(jié)果

2.3.1 大體病檢 14 d組的VX2瘤呈灰白色，質(zhì)地均勻，無壞死囊變。28 d組與42 d組的VX2瘤瘤體中心見不規(guī)則的斑片狀壞死囊變（圖2A）；肝內(nèi)轉(zhuǎn)移見肝內(nèi)多發(fā)大小不等的灰白色結(jié)節(jié)。

2.3.2 鏡檢 低倍鏡下肝內(nèi)多發(fā)瘤巢，與周圍肝實質(zhì)分界不清，瘤內(nèi)實質(zhì)成分較多而結(jié)締組織少，瘤細(xì)胞之間可見新生毛細(xì)血管（圖2B）；高倍鏡下瘤細(xì)胞體積大、排列不規(guī)則，胞核大而濃染，胞質(zhì)豐富（圖2C）。

3 討論

圖1 A-C分別為28 d組VX2瘤的T1WI、T2WI、DWI圖像；顯示VX2瘤在T1WI為稍低信號，T2WI為不均勻稍高信號，DWI上其中心區(qū)域可見斑片狀低信號

圖2 A為28 d組VX2瘤的大體病理標(biāo)本，可見腫瘤中心的斑片狀壞死囊變區(qū)；B為低倍鏡下病理圖片顯示肝內(nèi)瘤巢；C為高倍鏡下病理圖片顯示瘤細(xì)胞體積大、形態(tài)不規(guī)則，核大而濃

3.1 兔VX2腫瘤模型的建立 兔VX2腫瘤是由Shop等[1]使用病毒在兔皮膚誘導(dǎo)出的乳頭狀瘤，經(jīng)72次傳代培養(yǎng)后，建立起來的鱗癌細(xì)胞株。兔肝VX2瘤從生長特征、轉(zhuǎn)移及死亡、病理過程均與人類肝癌相似，且模型穩(wěn)定，復(fù)制性強、種植成功率高、成型周期短等特點，易被超聲、CT、MRI等發(fā)現(xiàn)和檢測，可用其進(jìn)行肝癌的影像學(xué)、治療學(xué)及抗腫瘤藥物的藥代動力學(xué)等實驗研究，是目前最大、最成熟和最常用的肝癌腫瘤模型[2]。兔肝VX2腫瘤模型一般可分為3個生長時期：實質(zhì)期（種植后2～3周），壞死期（種植后4～5周），囊變期（種植后6～7周）[3]。

兔VX2肝癌模型的制作方法主要有3種：經(jīng)肝動脈插管或經(jīng)皮肝穿刺注射瘤細(xì)胞、無菌下開腹瘤塊種植。前二者成功率較低，小于70%，后者成功率多大于90%[4-7]。本研究采用開腹瘤塊種植的方法，肝內(nèi)種植成功16只，成瘤率僅70%。究其原因：一方面，經(jīng)驗不足，沒有取到活力最強的瘤株；另一方面，術(shù)后天氣寒冷，兔生活環(huán)境潮濕導(dǎo)致3只兔術(shù)后腹瀉死亡。因此，兔肝VX2瘤的成功種植主要取決于：（1）瘤塊的制備，應(yīng)選擇生長2～3周的腫瘤，注意剔除外層纖維組織與中央壞死組織而選擇灰白色魚肉樣腫瘤組織。（2）選擇恰當(dāng)?shù)拈_腹切口與植入口，減小手術(shù)創(chuàng)傷；植入瘤塊時，盡可能使瘤塊種植在肝左葉深部，靠近較大血管支以便獲得血供；植入瘤塊后，及時用明膠海綿壓迫止血。（3）保持兔生活環(huán)境的干燥、通風(fēng)，特別注意防止腸道疾病。此外，還應(yīng)避免使用體重在1.5 kg以下、3個月齡以下的實驗兔，因為其耐受力低，更易患腸道疾病。因此，開腹瘤塊種植法建模，易受多種因素的影響，成瘤率偏低。

3.2 不同時期兔肝VX2瘤3.0 T MR表現(xiàn)特征分析 3.0 T MR常規(guī)序列基本可以反應(yīng)腫瘤的生長情況，且在瘤體壞死囊變等不同成分的識別上具有一定優(yōu)勢。DWI是MR功能成像技術(shù)，它由不同組織間水分子擴散運動的差異造成的信號衰減來反映組織的結(jié)構(gòu)特性，提供了與以往T1WI、T2WI不同的新的成像方式，是目前唯一能夠在活體檢測組織內(nèi)水分子擴散運動的無創(chuàng)性方法[8]。隨著MR軟硬件技術(shù)的發(fā)展，回波平面成像（echo planar imaging，EPI）技術(shù)及敏感性編碼成像（sensitivity encoding，SENSE）技術(shù)的出現(xiàn)，使得DWI成功地應(yīng)用于肝臟等腹部器官[9-11]。VX2瘤為實體性腫瘤，水分子擴散明顯受限，因而在DWI上呈明顯高信號，與周圍正常肝組織的對比鮮明。在MR常規(guī)序列及DWI圖像上，14 d組所有腫瘤信號均勻，病理檢查發(fā)現(xiàn)，僅1例出現(xiàn)液化壞死，考慮與實驗兔的體質(zhì)差異及種植位置較靠近肝邊緣、血供不足有關(guān)。從理論上講，液化壞死區(qū)在DWI上應(yīng)表現(xiàn)為不同程度的低信號，該例的液化壞死區(qū)在DWI上卻仍為高信號，肉眼不能分辨其與腫瘤實質(zhì)的信號差異。這可能與腫瘤早期體積較小，液化壞死為小灶性，受部分容積效應(yīng)的影響所致。28 d組及42 d組的腫瘤在DWI圖像上均出現(xiàn)斑片狀低信號區(qū)，說明水分子在該區(qū)域的擴散受限不明顯，病理檢查證實為腫瘤內(nèi)的液化壞死，而常規(guī)序列T1WI均未檢出，T2WI僅檢出7例。因此，3.0 T MR常規(guī)序列尚不能及時有效地觀察到腫瘤內(nèi)部的液化壞死，而DWI可敏感檢出腫瘤的液化壞死，在反映腫瘤的生長特性方面較常規(guī)MR序列更具優(yōu)勢。

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