生存素與CD34在急性髓系白血病患者骨髓細胞中的表達

谷大偉， 馬 莉

(貴陽醫學院附屬醫院中心實驗室，貴州貴陽550004)

白血病是造血干/祖細胞于分化過程的不同階段發生分化阻滯、凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質性的造血系統惡性腫瘤［1］。白血病在世界范圍內的日漸高發且趨于低齡化也引起學者們的廣泛關注，大量研究表明白血病的發生與癌基因的激活、抑癌基因的失活及細胞凋亡受抑有關［2］。生存素(survivin)又名存活素，是凋亡抑制蛋白家族中迄今為止最強的凋亡抑制因子［3］。survivin大量表達于胚胎及嬰幼兒組織中，正常組織中只有少量表達，而在60余種腫瘤細胞株和大部分人體腫瘤組織中過度表達［4-7］，也包括白血病細胞系［8］。白細胞分化抗原34(CD34)是造血干細胞或(和)祖細胞的特異性標志，正常人骨髓中只有少量CD34+細胞，約占單個核細胞的1.0%～4.0%［9］，在急性髓系白血病(AML)細胞上則有較高頻率的表達。多數學者認為AML中CD34的表達與AML的低緩解率及短生存期有關，僅少數學者認為CD34+AML與CD34－AML病例的緩解率、無病生存期無差異［10］。而關于AML患者骨髓細胞survivin基因與CD34共表達的研究鮮見報道。我們利用流式細胞術檢測骨髓細胞中survivin和CD34的表達，探討二者對白血病發生、發展的影響，從而為白血病的診療提供新思路、新方法。

材料和方法

一、對象

1.AML組 選取2010年4月至2011年1月貴陽醫學院附屬醫院血液科收治的AML患者共62例，所有病例經臨床及實驗室檢查確診，符合世界衛生組織(WHO)診斷標準及英美法協作組(FAB)診斷標準［1］。其中男28例、女34例，年齡19～60歲。62例AML患者根據治療后是否緩解分組。(1)治療未緩解組:38例，確診后經過2～4個月的臨床治療未達到目前公認的完全或部分緩解標準［1］;(2)治療緩解組:24例，確診后經過2～4個月的臨床治療達到目前公認的完全或部分緩解標準［1］。

2.對照組 2010年4月至2011年1月貴陽醫學院附屬醫院血液科收治的非惡性血液病患者31例(包括缺鐵性貧血13例、特發性血小板減少性紫癜3例、傳染性單核細胞增多癥5例、骨髓未見明顯異常10例)，其中男13例、女18例，年齡23～59歲。所有病例經臨床及實驗室檢查確診，且采集標本時未接受任何臨床治療。

二、方法

1.標本采集 髂前或髂后上棘部位進行穿刺抽取骨髓液1 mL，立即置于含有2 mL肝素抗凝劑的生化管中，輕輕上下顛倒搖勻，避免骨髓液凝固，立即送檢。

2.儀器與試劑 儀器為FACS-Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。白血病免疫分型試劑［CD45-Percp、CD10-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD19-藻紅蛋白(PE)、CD20-FITC、CD5-PE、CD2-FITC、CD22-PE、CD7-FITC、CD33-PE、CD15-FITC、CD11b-PE、CD34-FITC、CD14-PE、HLA-DR-FITC、CD13-PE、IgG1-FITC/IgG2a-PE;survivin檢測抗體Survivin-Alexa Fluor488］由美國BD公司和美國Cell Signaling公司提供的。

3.流式細胞術檢測 取100μL骨髓標本，分別加入各熒光標記抗體20μL，充分混勻后室溫(15～22℃)避光孵育20 min;再加入10×紅細胞裂解液1 mL，混勻后室溫(15～22℃)避光8 min，再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL，1 000×g離心5 min，棄上清，重復1次;棄上清，加入適量PBS充分混勻，進行流式細胞儀檢測。運行FACSComp軟件，以BD三色流式細胞儀定標試劑定標，調節電壓及補償于最佳狀態，使用CELLQuest軟件進行免疫分型及 survivin檢測分析。

三、統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗、方差分析和組間多重比較，實驗結果以±s表示，檢驗水準α=0.05，P＜0.05表示差異有統計學意義。表中各組數據多重比較前均進行了單樣本的K-S檢驗和獨立樣本的t檢驗，確定各組數據均呈正態分布且具方差齊性(P＜0.01)。

結 果

一、各組survivin+/CD34+雙表達分析

AML治療未緩解組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達均明顯高于AML治療緩解組和非惡性血液病組(P＜0.01、P＜0.05)，而非惡性血液病組和AML治療緩解組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1、圖1。

表1 各組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達比較(±s)

表1 各組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達比較(±s)

注:與AML 治療未緩解組比較，*P＜0.05、＊＊P＜0.01

AML 治療緩解組 24 4.06±1.41# 14.32±7.53*

圖1 各實驗組survivin及CD34+表達情況

二、AML治療未緩解組survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的分析

AML各亞型間存在抗體表達的差異，特別是AML-M3型白血病特征性的不表達CD34。本研究將這一特點結合survivin的表達及分析數據將AML治療未緩解組進一步分為survivin+/CD34+雙表達較高的A組(22例)、有survivin+/CD34+雙表達也有survivin+/CD34－表達的B組以及 survivin+/CD34－表達較高的C組，見圖2～4，比較3組間survivin+/CD34表達的差異。C組survivin+/CD34+雙表達明顯低于A組和B組(P＜0.01、P＜0.05)，而 A 組與B組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。A組survivin+/CD34－表達明顯低于B組和C組(P＜0.01)，而 B組和C組之間差異無統計學意義(P＜0.05)。見表2。

圖2 survivin+/CD34+雙表達較高的A組

圖3 survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的B組

圖4 survivin+/CD34－表達的C組

表2 AML治療未緩解組3亞組間survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的比較(±s)

表2 AML治療未緩解組3亞組間survivin+/CD34+雙表達和survivin+/CD34－表達的比較(±s)

注:與A 組比較，*P＜0.01，與B 組比較，#P＜0.05

組 54.38±16.88 C 組 8 2.93±3.55*# 57.53±25.10*

討 論

survivin屬于凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族，具有抑制細胞凋亡、調控細胞周期的作用，廣泛表達于人體的各種腫瘤組織中，通過直接或間接抑制caspase通路而發揮抗凋亡的作用。王會等［11］的研究提出survivin的治療可以有效地殺死腫瘤細胞，并且最大限度地減少對正常細胞的毒性作用，有望成為一種廣譜的腫瘤診斷標記物，并可能是抗腫瘤治療的重要標靶。林鳳如等［12］應用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RTPCR)檢測survivin在急性白血病骨髓細胞中的表達，結果提示survivin表達陽性者明顯高于對照組，獲得完全緩解率明顯低于survivin陰性組，且預后較差。Mori等［13］在對survivin在白血病中表達的研究中發現，在31例AML及16例急性淋巴細胞白血病中，分別有17例及11例陽性表達survivin，其中M3型AML survivin表達水平最低;在慢性髓系白血病的慢性期沒有檢測到survivin的表達，而在7例急變期的病例中檢測到survivin的表達;二甲亞砜、全反式維甲酸、腫瘤壞死因子可下調HL-60細胞的survivin表達水平，故認為survivin與造血細胞的分化及白血病的發生有關。王曄［14］的研究表明survivin和bcl-2協同作用，促進白血病的發生、發展。張嵐等［15］通過構建含有人survivin基因的表達質粒并轉染K562細胞的研究方法，結果發現急性白血病患者survivin mRNA的表達陽性率高于正常對照組，且其表達量在初發、復發及緩解時都較正常對照高。這些研究都提示survivin表達紊亂可能在急性白血病的發病過程中起重要作用，且有可能成為治療及預后的指標之一。陳璽等［16］應用蛋白印跡法檢測18例白血病患者化療前和10名正常對照組外周血中單個核細胞survivin蛋白的表達，并與患者的臨床特點進行相關性分析，結果發現survivin基因可選擇性地在白血病細胞中表達，提示survivin表達與白血病的發生有一定的關系。另外李文琦等［17］的研究也表明在成人(ALL)患者中，survivin的高表達可能造成預后不良。目前國內外關于survivin的研究都是以治療前的白血病患者與健康人進行對照，以此分析評價白血病患者在未經治療的疾病狀態下其骨髓中survivin基因的表達情況。這樣的對照研究只能反映患者一個狀態時的狀況，而不能動態綜合評價這一因素在白血病發生過程中的作用。本研究通過檢測在監測期內未轉化為惡性血液病的患者和AML患者骨髓細胞中survivin的表達，探討survivin在非惡性血液病以及AML骨髓細胞中表達的差異情況。同時將AML組分為治療未緩解組和治療緩解組，比較AML患者在經治療未達緩解標準及經治療達到完全或部分緩解標準時survivin的表達變化情況，以此對survivin在AML發生發展過程中的作用以及對臨床治療預后的影響綜合分析。另外本研究選用的流式細胞術較之目前普遍應用的RTPCR法，不僅可以將骨髓細胞上survivin的表達定性，同時可以將這種表達定量分析，也使研究結果更具有說服力。

本研究顯示，加入了 survivin檢測抗體的AML患者的骨髓流式細胞分析圖中，survivin的表達并不只在異常增生的原始細胞中，所有骨髓細胞中都有survivin的表達，提示白血病發病時survivin表達的增多可能抑制了骨髓中所有細胞的正常凋亡，且這種異常表達可能不受白血病分型的影響。AML治療未緩解組骨髓中survivin的表達均明顯高于AML治療緩解組和非惡性血液病組，提示survivin在骨髓細胞中的表達對白血病治療效果及預后有可能有預估作用。survivin高表達的AML病例后期經治療緩解率低或不能緩解，這與survivin的細胞選擇性表達的特性一致，表明survivin可能對白血病的發生、發展及預后有影響作用，也與張向峰等［18］的研究結果相類似。本研究中非惡性血液病組survivin的表達明顯低于AML治療未緩解組，而與AML治療緩解組無明顯差異。本研究推測survivin表達偏低時可能可以降低其他血液疾病轉化為白血病的風險，提示對survivin的檢測可以作為對非惡性血液病轉化為白血病風險的預估指標。此外，本研究中共收取非惡性血液病患者34例，其中3例survivin表達較高，且實驗期間轉化為骨髓增生異常綜合征(MDS)或白血病。本研究將survivin表達較低的31例非惡性血液病作為對照組，且在半年多研究期間暫未轉化為惡性血液病，是否提示survivin表達的升高有利于細胞逃離生長調控，促進白血病細胞的過度增殖蓄積，從而引發白血病的發生還有待今后大樣本量的更加深入的研究。CD34是造血干/祖細胞的特征性標志，近年國外文獻報道部分造血系統惡性腫瘤尤其是急性白血病存在早期分化抗原，如CD34、CD90和CD133的異常表達，作為干/祖細胞標志又是重要黏附分子的CD34與急性白血病的發生、發展有密切關系。因此CD34的檢測可以使白血病療效的觀察更具有針對性。本研究將CD34+在AML各表型間表達情況不盡相同的特點與survivin的表達對AML的影響作用相結合，把AML初發病例的治療未緩解組按表達情況進一步分組加以分析。結果顯示被檢測的AML病例中所有提示有CD34+表達的病例均伴有survivin的表達，但所有提示有survivin表達的AML病例卻并不都伴有CD34+的表達。在CD34+不表達或表達較低的AML患者中，survivin基因高表達的患者同樣緩解率低或不能緩解。因此可以推斷當骨髓細胞中開始出現異常增生的原始細胞時，survivin的過度表達可能比CD34有更顯著的病變提示價值。不久的將來通過更多更加深入的研究，survivin將可能成為臨床診斷和治療白血病的新的更為理想的標志物和靶點。

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