直接免疫熒光法病毒抗原測定在呼吸道感染性疾病診斷中的應用

俞小衛， 王亞楠， 程寶金， 馬玲娣

(1.南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院呼吸科，江蘇常州213003;2.南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院兒科，江蘇常州213003;3.南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院中心實驗室，江蘇常州213003)

上呼吸道的感染大多是由病毒感染所引起，特別是在兒童、青少年階段，病毒感染較為頻繁［1］。隨著2003年SARS病毒的大肆傳染和2009年甲型流感的爆發至今，我們越來越意識到呼吸道病毒檢測的重要性。目前，呼吸道病毒檢測的方法有很多，但都存在著各種各樣的不足，難以在臨床檢查中推廣。多數醫療機構對于呼吸道感染很少進行病原學檢測，特別是病毒的檢測，而是直接使用抗菌藥物進行治療，從而造成了抗菌藥物的濫用，不但延誤了病毒性疾病的診治，而且無形中增加了患者的醫療負擔。為了解呼吸道感染中病毒感染的情況，我們采用直接免疫熒光法檢測了呼吸道感染患者7種病毒抗原［包括呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒A(InfA)、流感病毒 B(InfB)和副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)］。

材料和方法

一、標本來源

2010年12月至2011年5月在常州市第二人民醫院住院的呼吸道感染患者762例，其中成人38例(男25例，女13例，年齡21～83歲)、兒童724例(男439例，女285例，年齡1 d～17歲)。

二、試劑與設備

1.檢測試劑 呼吸道病毒抗原檢測試劑盒［美國Diagnostic Hybrids公司，已通過美國藥品食品監督管理局(FDA)認證用于體外診斷］，包括單克隆熒光標記的7種抗體(RSV、ADV、InfA、InfB以及PIV1、2、3)，濃縮洗滌液磷酸鹽緩沖液(PBS，40×)，封閉液，抗原對照玻片，另外需配備冷丙酮。

2.檢測設備 熒光顯微鏡，37℃水浴箱，渦旋振蕩器等。

3.檢測材料 絨植拭子、載玻片、蓋玻片等。

三、方法

1.標本的采集 將配套的絨植拭子經鼻腔插入到達鼻咽部約7～8 cm。來回旋轉2～3次后迅速抽出拭子，放入加有3 mL PBS(10×)的塑料試管中，蓋上蓋子送檢。

2.標本處理 將絨植拭子標本在漩渦混勻器上輕微混勻3下(約30 s)，見渾濁后去掉絨植拭子。以700×g離心10 min。棄去上清液(留約100～150μL)，吸管吹打混勻，形成混濁細胞懸浮液。

3.標本制片 標本點樣在載玻片上(約10～15μL)，電吹風機冷風下風干10～15 min至干燥，浸沒在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

4.標本反應 每份標本分別加D3試劑1滴(25μL)，必須完全覆蓋待測標本。將載玻片放在濕盒中置于37℃培養箱(或放在泡沫上置于37℃水浴箱)孵育15～30 min。載玻片用PBS沖洗1次，后浸沒在PBS中洗2次(PBS不能重復使用)。

5.標本觀察 玻片中央加1滴封閉液，蓋上蓋玻片。

四、統計學方法

用SPSS 17.0軟件進行χ2檢驗，P＜0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

一、陽性結果

熒光顯微鏡下顯示蘋果綠熒光的細胞為陽性細胞，而被Evans藍染成紅色的細胞為陰性細胞。當放大倍數為200倍時，在視野中找到≥2個陽性細胞判為標本陽性。見圖1、圖2。

圖1 呼吸道RSV感染熒光顯微鏡下圖像

圖2 呼吸道病毒陰性熒光顯微鏡下圖像

二、7種病毒的陽性檢出率

在762例患者中，陽性例數為264例，陽性檢出率為34.65%。其中陽性率最高的是RSV(70.45%)，其次為PIV3(10.98%)。見表1。

三、不同季節呼吸道病毒感染情況分析

經χ2檢驗，不同季節呼吸道病毒的感染率不同(P＜0.05)。由于本研究標本在12月～5月間采取，經歷了冬季、春季。隨著氣溫的升高，病毒的檢出率逐漸降低，冬季要明顯高于春季。另外，雖然隨著氣候變暖，RSV的檢出率降低，但在7種病毒中仍占主要地位;PIV3檢出率增加的幅度較大。見表2。

表1 7種病毒的陽性檢出率

表2 不同季節7種病毒的檢出情況 ［例(%)］

四、18歲以下不同年齡組患兒呼吸道病毒的感染情況

經χ2檢驗，不同年齡組患兒的感染率不同(P＜0.05)，其中6個月以內嬰兒的感染率較高，之后隨年齡的增長而逐漸降低。由于成人標本數較少，因此不做此方面的統計。見表3。

五、兒科常見臨床診斷與病毒感染的情況

從構成比看，呼吸道病毒感染在喘息性支氣管肺炎、毛細支氣管炎、支氣管肺炎和一般肺炎較高，其檢測例數也比較多。毛細支氣管炎的陽性檢出率最高，達64.21%，其次為喘息性支氣管肺炎，占45.91%。見表4。

表3 18歲以下不同年齡組患兒呼吸道病毒的檢出率

表4 臨床診斷與呼吸道病毒感染

討 論

病原學檢測對于呼吸道感染的診斷和治療極為重要，有文獻指出95%的上呼吸道感染和大部分的下呼吸道感染是由細菌以外的病原體引起，其中病毒最為常見［2］。因此進行早期快速的呼吸道病毒檢測十分必要。有研究證明呼吸道病毒抗原檢測陽性結果的患者接受抗菌藥物治療的時間明顯縮短，這樣即可以減少抗菌藥物的使用，又使住院時間縮短［3-4］。

對于呼吸道病毒的檢測，目前主要的方法有分離培養鑒定、核酸檢測以及抗原抗體的檢測。FDA認為，病毒感染需用免疫熒光檢測、病毒培養或聚合酶鏈反應(PCR)來確認，原因是其他方法的陰性結果無法排除流感病毒感染。就現有檢測方法來看各有優劣，分離培養雖是金標法，但此方法耗時較長，不利于早期指導臨床治療;PCR雖然敏感性高［5］，但其對實驗室的要求高，成本也高，難以普及。抗體的檢測目前應用較廣，但由于IgM抗體一般是在呼吸道病毒感染6 d以后才能檢測到，IgG抗體一般在治療后才會出現，檢測周期長，臨床應用不便［6］。相比較之下直接免疫熒光法抗原檢測更為簡便、快速且檢測成本較低，利于普及。

在本研究檢測的患者中，兒童占95.01%。而在所有感染者中，以RSV感染最為多見，占陽性病例的70.45%，此結果與國內外的報道一致［7-8］。不同年齡組患者的感染率也有所差異，有文獻指出，3歲以內兒童的陽性檢出率較3歲以上兒童高2.4倍之多，因此對于此年齡段兒童呼吸道病毒感染的確診較為重要［9-11］。本研究對3歲以內患兒進行繼續分析，6個月以內的嬰兒感染率較高，達44.18%，可能與這個時期嬰幼兒免疫功能低下有關，因此對6個月以內的患兒要重點關注。

另外，從兒科常見臨床診斷與病毒檢測的結果來看，毛細支氣管炎、喘息性支氣管肺炎陽性檢出率較高，而且多數患者在檢測呼吸道病毒感染之后使用了抗病毒的藥物進行治療，病情得到及時的控制。因此，當患者做此診斷時，是否為呼吸道病毒感染可作為首先考慮的方向之一。

成人下呼吸道病毒感染極易被忽視。本研究有1例患者因肺間質纖維化入院，住院期間受涼合并肺炎，經抗菌藥物治療數日未見好轉，后進行病毒抗原檢測，為InfA陽性，改用抗病毒藥物治療后痊愈。有研究表明下呼吸道感染患者病毒檢測陽性率遠遠高于健康人，提示對住院下呼吸道感染患者有必要開展呼吸道病毒的常規檢測［12］。

本研究結果表明，不同的季節呼吸道病毒感染的情況也不同，冬季明顯高于春季。春季陽性檢出率為25.45%，而冬季陽性檢出率高達44.23%。冬春兩季RSV的檢出率均最高，但除RSV以外的6種病毒中，InfA在冬季的陽性檢出率較高，而在春季PIV3的陽性檢出率較高，提示在冬季初春病毒感染的高發時節，要側重于RSV以及InfA感染的防治。隨著氣溫升高，RSV的檢出率逐漸降低，PIV3的檢出率逐漸升高。

綜上所述，直接免疫熒光法病毒抗原測定簡單、快速、實用，不但可用于呼吸道感染病毒病原體的早期快速診斷，還可用于各季節病毒流行的動態監測。

［1］孫志勤，周建明，張 丹，等.武漢地區1978年至1993年間小兒呼吸道病毒感染的實驗研究及流行病學分析［J］.中國實用兒科雜志，1994，9(1):42-43.

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