肥大細(xì)胞促早期胃癌形成及其生物學(xué)意義

劉亞楠， 藺麗慧， 王 娟， 李 佳， 彭 霞， 肖 輝， 李 飛， 戴慧蓉， 李 莉

(上海市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200080)

近年來炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受重視［1-2］，腫瘤組織中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤，其中肥大細(xì)胞(mast cell，MC)引起人們的廣泛關(guān)注。MC參與了多種腫瘤的形成與進(jìn)展，如胰腺癌、肝癌、肺癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌及胃癌等，同時(shí)部分研究認(rèn)為MC與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)［3-4］。但這些研究結(jié)果尚存在爭議。胃癌形成的Correa途徑［5-6］在癌癥病理變化中發(fā)揮重要作用，但MC在該疾病演變過程中的作用較少被關(guān)注。我們采用免疫組化法標(biāo)記MC，初步了解胃疾病演變過程(胃良性病變、胃癌前病變、胃癌)組織中MC的數(shù)目分布情況及其與患者生存期的相關(guān)性，并分析二者與臨床病理資料的關(guān)系，探討MC在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料和方法

一、材料

1.對象 選取2008年至2011年上海市第一人民醫(yī)院手術(shù)切除及胃鏡活檢標(biāo)本。胃癌標(biāo)本59例(高分化10例、中分化17例、低分化32例;Ⅰ期13例、Ⅱ期12例、Ⅲ期26例、Ⅳ期8例)，其中男24例，女25例，年齡27～86歲，TNM分期按國際抗癌聯(lián)盟1997年標(biāo)準(zhǔn)判定。胃癌前病變(慢性萎縮性胃炎伴腸化)標(biāo)本40例，其中男27例，女13例，年齡41～84歲。胃良性病變(慢性非萎縮性胃炎)標(biāo)本33例，其中男16例，女17例，年齡34～79歲。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 mm厚連續(xù)切片，進(jìn)行免疫組化。所有病例經(jīng)病理切片和免疫組化染色確診。

2.試劑 抗MC類胰蛋白酶的單克隆抗體(AA1，DAKO)、二步法抗兔/抗鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(EnVisionTMDetection KIT)購自基因科技(上海)有限公司。BASO蘇木素(梅爾氏)購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1.免疫組織化學(xué)染色 將切片脫蠟并梯度酒精水化，蒸餾水洗滌;檸檬酸緩沖液(pH值6.0)微波抗原修復(fù)15 min，切片完全冷卻后，PBS洗滌3次;3%H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶影響。5%牛血清白蛋白(BSA)封片30 min后，棄封閉液，加入1∶5 000稀釋的抗MC類胰蛋白酶的單克隆抗體50 μL，放濕盒內(nèi)4℃過夜孵育;磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌3次后加入二抗50μL，室溫孵育30 min;PBS充分洗滌3次后加入1∶50稀釋的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液50μL，顯微鏡下觀察，適時(shí)終止反應(yīng);BASO蘇木素(梅爾氏)染色30 s后流水內(nèi)充分返藍(lán);梯度酒精脫水后烤片5 min，中性樹膠封片。經(jīng)免疫組化染色，MC的胞漿呈棕色，避開組織邊緣及壞死區(qū)，各組織標(biāo)本在高倍視野下連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)MC密集區(qū)中MC數(shù)量，求其平均數(shù)。

2.隨訪 所有患者均采用電話方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間為2～54個(gè)月。無法與患者或家屬取得聯(lián)系者視為失訪。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用Shapiro-Wilk進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)。以±s表示MC在胃組織中的數(shù)量，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析或LSD法。根據(jù)疾病種類及MC繪制Kaplan-Meier生存曲線。

結(jié) 果

一、不同病變組織中MC免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

被染成棕色的MC主要分布在胃腺泡的間質(zhì)及上皮下。其中胃癌、胃癌前病變組織中的MC數(shù)量明顯高于胃良性病變組織;胃癌前病變組織中的MC數(shù)量明顯高于胃癌組織，見圖1。

二、各組MC計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

胃癌組、胃癌前病變組、胃良性病變組MC數(shù)量經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)分析符合正態(tài)分布，P值依次為0.102、0.315、0.916。胃癌組、胃癌前病變組、胃良性病變組標(biāo)本每個(gè)高倍視野平均MC個(gè)數(shù)依次為29±11、40±12、20±5。3組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.05)。見圖2。

圖1 免疫組化標(biāo)記類胰蛋白酶陽性MC(×100)

三、胃癌前病變組織MC數(shù)量與各臨床病理資料關(guān)系

幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)(+)胃癌前病變患者的MC數(shù)量明顯高于HP(－)的患者(P＜0.05);而炎癥程度及活動性、組織萎縮程度及腸化生程度之間MC數(shù)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均＞0.05)，見表1。

圖2 胃癌變組織中肥大細(xì)胞數(shù)量比較

表1 胃癌前病變患者臨床病理資料與MC數(shù)量的關(guān)系

四、胃癌組織MC數(shù)量與各臨床病理資料關(guān)系

HP(－)和HP(+)組MC數(shù)量比較有明顯差異(P＜0.05)，Ki-67的表達(dá)強(qiáng)弱程度之間MC數(shù)量有明顯差異(P＜0.05);腫瘤TNM分期、浸潤深度、分化級別、局域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤程度之間MC數(shù)量無明顯差異(P＞0.05)。見表2。

表2 胃癌患者臨床病理資料與MC數(shù)量的關(guān)系

五、預(yù)后情況

胃癌組、胃癌前病變組分別以MC數(shù)量的中位數(shù)(28、43)為界限各分為2組。胃癌及胃癌前病變中MC高水平組與低水平組生存期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。見圖3。

圖3 胃癌及胃癌前病變患者M(jìn)C高水平組與低水平組生存期比較

討 論

炎癥反應(yīng)在腫瘤形成發(fā)展的不同時(shí)期均發(fā)揮著重要作用，包括腫瘤始發(fā)、進(jìn)展、惡性轉(zhuǎn)化、浸潤和轉(zhuǎn)移［1］。許多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤起源于炎癥部位。應(yīng)用非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)的個(gè)體患腫瘤的幾率減少，這提示炎癥能增加腫瘤易感性。同時(shí)，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)應(yīng)用NSAIDs能明顯降低胃腸道腫瘤患者死亡率［7］。慢性炎癥是胃癌發(fā)生的高危因素，多數(shù)與慢性感染有關(guān)，特別是HP。胃癌是一個(gè)多步驟進(jìn)行性發(fā)展的疾病。長期感染或其他因素導(dǎo)致慢性炎癥形成以腺體消失為特點(diǎn)的慢性萎縮性胃炎，隨著病情進(jìn)展部分患者發(fā)展為伴有腸化生或異型增生的癌前病變，而高達(dá)85%的非典型增生患者發(fā)展成胃癌［8］。但是導(dǎo)致這些病理變化的確切機(jī)制尚不十分明確。隨著人們對腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識，炎癥細(xì)胞的浸潤，特別是MC在微環(huán)境中的生物學(xué)作用被人們所關(guān)注。

MC是功能多樣的炎癥細(xì)胞，一直以來人們對MC的關(guān)注都集中在過敏反應(yīng)和抗感染方面?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤中，MC能直接影響腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲，同時(shí)釋放的多種生物活性介質(zhì)能重構(gòu)腫瘤微環(huán)境和調(diào)節(jié)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，最終影響腫瘤患者預(yù)后［3］。Ribatti等［9］發(fā)現(xiàn)MC通過促進(jìn)血管增生參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但沒有分析在胃良性病變到胃癌前病變直至胃癌發(fā)生這一疾病演變過程中MC的作用及與各臨床病理資料的關(guān)系。一些學(xué)者認(rèn)為MC在腫瘤中的作用不僅取決于腫瘤形成發(fā)展時(shí)期，還取決于腫瘤的類型［10］。Soucek 等［11］在胰腺癌模型中發(fā)現(xiàn)MC是腫瘤形成早期唯一增加的炎癥細(xì)胞并且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。Gounaris等［12］發(fā)現(xiàn)MC在結(jié)腸發(fā)生癌變中起到重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌前病變組織中MC平均數(shù)較胃良性病變高，提示MC可能在腫瘤形成早期發(fā)揮重要作用，這與以上文獻(xiàn)結(jié)果一致;胃癌組織中MC數(shù)量明顯多于良性病變，而比胃癌前病變組織中的有所減少。這說明在已形成的腫瘤中其生物學(xué)功能可能不再單純依賴MC數(shù)量。胃癌組織中MC平均數(shù)高于胃良性病變，而在高、中、低分化胃腺癌組織中無差異，說明MC在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮了一定的生物學(xué)作用，但與已形成的腫瘤的分化程度無明顯關(guān)系。Ki-67是細(xì)胞增殖的重要標(biāo)記［13］，腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)可作為預(yù)測惡性腫瘤發(fā)展及預(yù)后的指標(biāo)。本研究分析了27例胃癌組織中Ki-67的表達(dá)與MC的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)的強(qiáng)弱與MC數(shù)量存在明顯的相關(guān)性，提示MC參與腫瘤增殖與進(jìn)展?？傊?，MC參與腫瘤早期形成，而與腫瘤分化程度無關(guān)，推測可能與MC在腫瘤組織中的分布、亞型和活化狀態(tài)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌前病變患者中HP(+)高達(dá)40%，胃癌患者的陽性率為15.3%，同時(shí)MC與HP感染有明顯的相關(guān)性，即HP(+)患者病變組織中浸潤的MC增加。這與Nakajima等［14］的研究結(jié)果一致。HP感染是誘發(fā)萎縮性胃炎及病理進(jìn)展成胃癌的主要因素，早在1994年就被認(rèn)為是胃癌發(fā)生的Ⅰ類致癌物質(zhì)［15］。HP在胃癌形成中的作用也一直被人們探討研究，但仍存有疑問，單獨(dú)的HP感染并不足以誘發(fā)胃癌。以往研究發(fā)現(xiàn)HP釋放的VacA毒素能趨化MC到炎癥部位，同時(shí)來源于HP的中性粒細(xì)胞激活蛋白(neutrophilactivating protein，NAP)能誘導(dǎo)活化MC脫顆粒及合成釋放炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞素-6(IL-6)。de Bernard等［16］發(fā)現(xiàn)VacA毒素能活化 MC釋放炎性介質(zhì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)及IL-6。一些研究顯示IL-6在結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤早期發(fā)揮重要作用，通過NF-ΚB-IL6-STAT3途徑能促進(jìn)腫瘤始發(fā)細(xì)胞的增殖及抑制其凋亡。同時(shí)越來越多的證據(jù)顯示TNF-α也能促進(jìn)腫瘤的形成［17］。由此可見，宿主炎癥反應(yīng)中MC可能參與了HP感染誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生和進(jìn)展。早期趨化活化MC釋放各種炎癥介質(zhì)(如IL-6、TNF-α等)重構(gòu)腫瘤炎癥微環(huán)境或者與腫瘤細(xì)胞、腫瘤組織內(nèi)其他細(xì)胞直接或間接作用，亦或者降解微環(huán)境基質(zhì)及介導(dǎo)脈管新生，甚至微粒、外泌體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞功能作用。

腫瘤患者的預(yù)后與腫瘤類型、分期、分化程度、有無轉(zhuǎn)移浸潤等因素有關(guān)。近年許多研究者分析MC與腫瘤患者生存期的關(guān)系，認(rèn)為MC可作為獨(dú)立的腫瘤預(yù)后指標(biāo)，但是存在爭議。Ju等［18］研究肝癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中浸潤MC越多患者的預(yù)后越差。Xia等［19］研究發(fā)現(xiàn)ⅢB期結(jié)腸癌患者生存期與腫瘤組織中MC數(shù)目無關(guān)。本研究將胃癌患者依據(jù)組織MC中位數(shù)將其分為2組并分析其與生存期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MC高水平組與MC低水平組的生存期無明顯差異(P=0.867)，與Xia等［19］的研究結(jié)果一致;癌前病變組織中MC數(shù)量雖明顯高于胃癌組，但MC高水平組和低水平組的生存期比較亦無明顯差異(P=0.087)。因此，單純MC數(shù)量不能作為單獨(dú)的腫瘤預(yù)后指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)胃癌前病變組織中MC數(shù)量高于胃癌和胃良性病變，說明MC與腫瘤早期形成有關(guān)，尤其是HP感染誘發(fā)的腫瘤。MC可能成為腫瘤早期診斷治療干預(yù)的新靶點(diǎn)。同時(shí)MC與腫瘤患者的生存期無相關(guān)性，因此不能作為獨(dú)立的腫瘤預(yù)后指標(biāo)。由于本研究樣本量較少，具有一定的局限性。MC與腫瘤的關(guān)系需進(jìn)一步研究證實(shí)。此研究也有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識胃癌的形成和發(fā)展機(jī)制。

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