桑樹泛素延伸蛋白基因的原核表達

周曉慧，戴 斌，王 韡，陸小平

(蘇州大學金螳螂建筑與城市環境學院，江蘇蘇州215123)

泛素延伸蛋白(UEP)也稱泛素羧端延伸蛋白(CEP)，是氨端一個泛素分子和羧端一個核糖體蛋白(RLP)分子的融合蛋白。UEP基因轉錄和翻譯后的產物為前體蛋白，將在脫泛素酶(DUB)作用下形成泛素和核糖體蛋白［1］。真核生物中的泛素延伸基因分為兩類:一類C末端與52或53個氨基酸的蛋白質融合，這類融合的蛋白與核糖體L40(ribosomal L40)有很高的同源性;另一類與76～80個氨基酸的蛋白質融合，這類融合的蛋白質與核糖體S27a蛋白(ribosomal S27a)有很高的同源性。

泛素延伸蛋白的研究最早是在酵母中［2］，后在人類、線蟲、擬南芥和水稻等物種中均克隆出編碼該類蛋白的基因［3-4］。目前，國內外泛素延伸蛋白的研究主要集中在人、動物、昆蟲等領域［5］，如小菜蛾［6］、煙葉蛾［7］、甜菜夜蛾［8］泛素延伸蛋白基因克隆與表達的研究，而在植物中有關泛素延伸蛋白基因的研究很少。尤其是該基因在植物生物學功能中的調控作用及其作用機理還不清楚［9-10］。陸月賞等［11］利用實時熒光定量PCR對玉米泛素延伸蛋白基因(ZmERD16)的組織表達特異性和在不同脅迫條件下的表達譜進行了分析，認為ZmERD16可能參與玉米的多種脅迫信號傳導和逆境應答。目前，對木本植物泛素體系的研究尚處于起步階段［12］。在前期的工作中，利用3'RACE技術，從豐馳桑幼葉的總RNA中反轉錄并擴增出植物泛素延伸蛋白基因cDNA［10］。本研究對前期克隆的桑樹泛素延伸蛋白基因進行了生物信息學及原核表達分析，為進一步探討桑樹的逆境生理機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體

pGEM-T/Ube質粒(含有泛素延伸蛋白基因)、表達菌株E.coli BL 21、表達載體pGEX-4T-1均為植物栽培與生理實驗室保存。pGEM-T/Ube質粒、pGEX-4T-1經Bam HI和Eco RI雙酶切后，分別回收目的片段，用 T4 DNA連接酶14℃連接過夜，取10μL轉化E.coli BL21感受態細胞，篩選轉化子送交至上海捷瑞生物有限公司鑒定和測序后保存。

1.2 主要實驗試劑

LB液體培養基、Tris緩沖液、過硫酸銨(AP)、考馬斯亮藍、氨芐青霉素(Amp)、Bam HI/Eco RI均購自上海捷瑞生物工程有限公司，IPTG購自Novagen公司。

1.3 菌體培養

取3 mL LB液體培養基加Amp至質量濃度為50μg/mL，加入經鑒定含有陽性pGEX-4T-1的質粒菌，在200 r/min、37℃條件下恒溫振蕩培養過夜。次日按1%比例在新鮮培養基中加入200μL活化菌液接種到LB/Amp培養基進行誘導。

當菌液濃度OD600值約為0.5時加入誘導劑IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L進行表達誘導。在不同時間段對樣品進行取樣，于4℃冰箱中保存備用。

1.4 樣品處理及SDS-PAGE電泳

［13］操作。

2 結果與分析

2.1 重組質粒鑒定

抽取陽性轉化子質粒，并用Ba m HI和Eco RI雙酶切，酶切結果如圖1所示，雙酶切后出現大小在500 bp左右的片段，與測序結果一致。對重組質粒進行測序，結果表明:目的片段大小為471 bp，上游有一個起始密碼子ATG，下游有一個終止密碼子TAG，兩者之間是一個完整的開放閱讀框(ORF)，編碼156個氨基酸。說明重組質粒載體中含有桑樹泛素延伸蛋白基因片段，表達載體構建正確。

2.2 基因產物的生物信息學分析

根據所獲基因推演的蛋白序列可知，該蛋白的推測pI值是5.14，相對分子質量為17 800。卷曲螺旋是控制蛋白質寡聚化的元件，通過網站http://www.ch.embnet.org/cgi-bin/COILS_form_parser對卷取區進行預測。結果如圖2所示:在第10～40個氨基酸區域有存在卷曲螺旋結構的可能。

圖1 重組質粒的鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid

圖2 重組質粒卷曲螺旋結構預測Fig.2 Prediction of coiled-coil structure of recombinant plasmid

2.3 不同誘導時間對目的蛋白表達的影響

在37℃，200 r/min條件下，經濃度1.0 mmol/L IPTG誘導不同時間桑樹泛素延伸蛋白基因蛋白的表達量。結果如圖4中箭頭所示:表明經IPTG誘導0～6 h內泛素延伸蛋白表達量隨時間延長表達量明顯增加，6 h時表達量沒有明顯變化。未經IPTG誘導的BL 21(pGEX-4T-1)只能看到非常淺的條帶，這與生物信息預測結果一致，說明目的基因能夠在宿主細胞中誘導表達。

圖3 桑樹泛素延伸蛋白跨膜結構Fig.3 Transmembrane structure of ubiquitin extension protein in mulberry

圖4 桑樹泛素延伸蛋白基因轉化BL 21不同時間誘導表達Fig.4 Inducible expression of mulberry ubiquitin extension protein gene transforming BL 21 at different time

3 結論

通過本實驗表明，桑樹泛素延伸蛋白基因與其他植物具有較高的同源性［5］，這使得今后利用模式植物研究其功能及分子進化分析更加高效。此外，該基因能夠在原核細胞大腸桿菌中正確表達，37℃條件下，經1.0 mmol/L的 IPTG誘導后，在相對分子質量為40 000前后有明顯的條帶出現，這與預測結果(目的蛋白相對分子質量17 800和pGEX-4T中的GST蛋白相對分子質量26 000的融合產物)一致，蛋白表達量隨時間的推移顯著增加。劉嘉琦等［13］只對不同溫度及不同載體對泛素延伸蛋白的表達影響進行了研究，結果表明，在30℃條件下0.5 mmol/L的IPTG誘導8 h表達量最高。由于本實驗僅在不同時間對目的基因原核表達影響進行了研究，經1.0 mmol/L的IPTG誘導6 h后，在相對分子質量40 000前后有明顯條帶，但尚未因溫度、誘導劑濃度等不同條件對原核表達影響進行研究。目前對泛素延伸蛋白基因表達機理尚不清楚，還需要進一步的實驗研究。

參考文獻:

［1］SMALLE J，VIERSTRA R D.The ubiquitin 26S proteasome proteolytic pathway［J］.Annual Review of Plant Biology，2004，55:555-590.

［2］OZKAYNAK E，FINLEY D，SOLOMON M J，et al.The yeast ubiquitin genes:a family of natural gene fusions［J］.The EMBO Journal，1987，6(5):1429-1439.

［3］BAKER R T，BOARD P G.The human ubiquitin-52 amino acid fusion protein gene shares several features with mammalian ribosomal protein genes［J］.Nucleic Acids Research，1991，19(5):1035-1040.

［4］CALLIS J，RAASCH J A，VIERSTRA R D.Ubiquitin extension protein protein of Arabidopsis thealiana［J］.The Journal of Biological Chemistry，1990，265:12486-12493.

［5］王利芬，陳正凱，陸小平.桑泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析［J］.生物技術，2007，7(14):6-10.WANG Lifen，CHEN Zhengkai，LU Xiaoping.Cloning and characterization of ubiquitin extension protein gene fragment of mulberry［J］.Biotechnology，2007，7(14):6-10.

［6］李曉梅，陳永，李珣，等.小菜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆與原核表達［J］.華中農業大學學報，2011，30(1):54-60.LI Xiaomei，ZHANG Yong，LI Xun，et al.Cloning and expression profile of ubiquitin extression protein from Plutella xylostella［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，2011，30(1):54-60.

［7］徐洪濤，安世恒，郭線茹，等.煙夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆與表達［J］.農業生物技術學報，2006，14(6):884-888.XU Hongtao，AN Shiheng，GUO Xianru，et al.Cloning of ubiquitin extension protein gene from Helicoverpa assulta and its expression in Escherichia coli［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2006，14(6):884-888.

［8］牛國棟，張海元，張忠信.甜菜夜蛾泛素延伸蛋白基因cDNA的3'RACE-PCR擴增及其克隆和表達［J］.昆蟲學報，2004，47(2):166-170.NIU Guodong， ZHANG Haiyuan， ZHANG Zhongxin.Amplication with 3'RACE-PCR，cloning and prokaryotic expression of ubiquitin extension pretension protein cDNA of Spodotera exigua(Lepidoptera:Noctuidae)［J］.Acta Entomologica，2004，47(2):166-170.

［9］HANANIA U，VELCHEVA M，SAHAR N，et al.Suppression and over expression of ubiquitin extension protein S27a affects cell proliferation and in vitro regeneration in Nicotiana benthamiana.［J］.Plant Science，2009，176(4):566-574.

［10］宋曉毅.本氏煙泛素延伸蛋白基因的功能分析［D］.杭州:浙江大學，2008.SONG Xiaoyi.Functional Analysis of a Nicotiana Benthamiana Ubiquitin Extension Protein Gene［D］.Hangzhou:Zhejiang University，2008.

［11］陸月賞，劉穎慧，張登峰，等.玉米泛素延伸蛋白基因ZmERD16的克隆、序列特征和表達分析［J］.作物學報，2010，36(7):1075-1083.LU Yueshang，LIU Yinghui，ZHANG Dengfeng，et al.I-dentification and expression analysis of ZmERD16:a ubiquitin extension protein gene in maize［J］.Acta Agronomica Sinica，2010，36(7):1075-1083.

［12］賈培義，董麗，王彥杰，等.牡丹泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析［J］.生物技術，2010，20(4):1-3.JIA Peiyi，DONG Li，WANG Yanjie，et al.Cloning and characterization of ubiquintin extension protein gene in Paeonia suffruticosa［J］.Biotechnology，2010，20(4):1-3.

［13］劉嘉琦，樓程富，袁紅艷，等.桑樹低溫誘導蛋白基因(Wap25)的原核表達［J］.中國蠶業，2009，30(3):25-28.LIU Jiaqi，LOU Chengfu，LU Xiaoping，et al.Prokaryotic expression of low temperature induced protein gene(Wap 25)in mulberry［J］.Sericulture in China，2009，30(3):25-28.