腦出血患者急性期血清HMGB1、ENA－78和S100β蛋白水平的變化及依達拉奉的干預作用

詹利英 凌 芳 華 梅

腦出血是目前威脅中老年健康的常見病和多發病，其致殘率和致死率均較高，其病理生理改變主要為血腫的占位效應和周邊水腫帶的形成，其發病機制復雜，在腦出血后的繼發性損害中涉及自由基損傷、炎癥反應、細胞凋亡等多個途徑，這一系列的級聯反應形成的瀑布效應加重了神經元細胞損傷。臨床上對于輕中度腦出血往往采取內科保守治療，但如何有效地實施腦保護和促進神經功能恢復是目前研究的熱點和難題。依達拉奉（Edaravone）是一種新型的自由基清除劑，目前已廣泛應用于缺血性腦卒中患者，且已證實對腦缺血時神經元細胞具有保護作用，可有效地減少細胞毒性反應后自由基的產生，但在出血性腦卒中患者中應用尚不廣泛。為了研究依達拉奉是否對腦出血具有保護治療作用，本研究對160例高血壓性腦出血患者采取隨機對照研究，通過檢測血清高遷移率族蛋白－1（High mobility group box－1，HMGB1）、中性粒細胞激活肽－78（Epithelial neutrophil activating peptide－78，ENA－78）和S－100β蛋白（S－100βprotein）水平和觀察神經功能缺損評分的變化來探討依達拉奉對腦出血的可能保護作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取武漢市第五人民醫院神經內科卒中單元2008年1月～2013年1月間高血壓性腦出血住院患者共160例，發病在24h以內，NIHSS評分在4～22分，全部病例符合1995 年中華醫學會第四次全國腦血管病學術會議修訂的腦出血診斷標準，并且入院經頭顱CT 確診為基底節區出血，出血量10～30 ml。嚴格遵循隨機、對照、單盲的原則，分為依達拉奉組和常規治療組。依達拉奉組80例，平均年齡（61.58±7.74）歲，其中男42例，女38例。常規治療組80 例，平均年齡（59.40±8.18）歲，其中男39例，女41例。

對照組：系同期我院體檢健康者100例，各項體檢均正常，其中男55 例，女45 例，平均年齡（55.13±14.29）歲。

排除標準：（1）出血量大于30 ml，腦出血破人腦室或蛛網膜下腔；（2）既往有腦出血史、腦外傷后出血、腫瘤出血、多灶性出血；（3）患糖尿病、嚴重心肝腎功能不全，并發感染。

退出標準：（1）用藥過程中出現嚴重毒副反應；（2）出現心腦血管病復發事件；（3）患者突發意外死亡。

所有研究對象用藥均征得患者本人和家屬同意，符合武漢市第五醫院倫理委員會制定的倫理學標準，簽署治療同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療 常規治療組和依達拉奉組均使用甘露醇、甘油果糖和速尿脫水、降顱內壓、調控血壓（施慧達）和補液治療，脫水劑使用一般不超過14 d；依達拉奉組在上述基礎上加用依達拉奉注射液（其商品名為必存，每支10 mg針劑，南京先聲藥業生產）30 mg加入100 ml生理鹽水，每日2次，療程為14 d。常規治療組使用等容積安慰劑生理鹽水。兩組治療期間均不再使用其他氧自由基清除劑及腦保護劑如尼莫地平等。

1.2.2 臨床神經功能缺損評分 神經功能缺損評分采用1989年的美國國立衛生院卒中量表（NIHSS），日常生活能力評分（ADL）標準采用Barthel指數（BI）和斯堪的納維亞卒中量表（SSS）評定。均由卒中單元中經過培訓的神經內科專職人員負責評分并錄入。在患者入院治療前、治療后第1周、第2周和第3周分別評分1次。

1.2.3 生化檢測

對照組于體檢日清晨抽取空腹靜脈血3 ml。腦出血患者入院后第1 d（治療前）、第3 d、第7 d和第14 d晨起空腹抽取靜脈血5 ml，盡快分離血清，－70 ℃低溫保存待測。檢測前凍融，采用雙抗體夾心ELISA 法測定血清HMGB1、ENA－78 和S100β水平，試劑盒均由武漢博士德公司提供，儀器為意大利產AZXM11－Alisei全自動酶標儀。操作嚴格按說明書進行，結果由酶標分析儀分析所得。此外，常規治療組和依達拉奉組入院后第1 d、第7 d和第14 d均抽血檢測血常規、尿規及肝腎功能、血脂、心肌酶學等。

1.2.4 統計學處理

應用SPSS17.0統計軟件，所有計量資料以均值±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析、治療前后指標比較采用配對t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用直線相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 常規治療組和依達拉奉組一般臨床資料比較

兩組患者一般資料（性別、年齡、血壓、血糖、體質量指數、血脂、入院時NIHSS評分、吸煙史、飲酒史、出血量、WBC 計數）均無明顯差異，具有可比性（P均＞0.05）（表1）。

表1 2組患者的一般臨床資料比較（±s）

表1 2組患者的一般臨床資料比較（±s）

項目 常規治療組（n＝80）依達拉奉組（n＝80）男／女（例／例） 39／41 42／38年齡（歲） 59.40±8.18 61.58±7.74收縮壓（mmHg） 153.90±5.63 154.56±7.29舒張壓（mmHg） 90.59±4.92 91.44±8.11空腹血糖（mmol／L） 5.99±0.78 6.13±0.72體質量指數（kg／m2） 23.24±2.45 22.63±2.28總膽固醇（mmol／L） 5.81±0.55 5.99±0.61甘油三酯（mmol／L） 2.34±0.55 2.38±0.59低密度脂蛋白膽固醇（mmol／L） 4.12±0.37 4.07±0.68高密度脂蛋白膽固醇（mmol／L） 1.32±0.18 1.29±0.21吸煙史（例） 39 36飲酒史（例） 39 41 NIHSS評分 14.54±4.99 13.86±4.70出血量（ml） 15.98±4.92 15.53±4.38 WBC（×109／L） 7.83±1.14 7.64±1.41

2.2 治療前后3組患者血清HMGB1、ENA－78和S100β水平的比較

在發病后第1 d，依達拉奉組和常規治療組患者血清HMGB1、ENA－78 和S100β水平均明顯升高（P均＜0.01），且達峰值，繼之出現緩慢下降。在發病后第14 d依達拉奉組和常規治療組三項指標仍高于對照組（P均＜0.01），但在發病后第3 d、第7 d、第14 d 依 達 拉 奉 組 血 清HMGB1、ENA－78 和S100β水平均明顯低于常規治療組（P＜0.01）（表2～4）。

2.3 治療前后2組SSS和ADL評分的比較

治療前兩組（常規治療組和依達拉奉組）患者SSS評分和ADL評分差異無顯著性（P均＞0.05）。在治療后第1周兩組患者SSS評分和ADL 評分較入院時降低，但在治療后第2周和第3周常規治療組和依達拉奉組患者SSS評分和ADL 評分逐漸上升。在治療后第2周和第3周依達拉奉組患者SSS和ADL評分明顯高于常規治療組（P均＜0.01）（表5、6）。

表2 3組血清HMGB1水平比較（±s，mg／L）

表2 3組血清HMGB1水平比較（±s，mg／L）

注：與同組治療前比較，＊P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01；與常規治療組比較，▲P＜0.01

組別 例數 治療前（第1天） 第3天 第7天 第14天對照組 100 0.92±0.23常規治療組 80 13.41±3.17＊ 10.22±2.50＊△ 7.49±1.77＊△ 4.02±1.04＊△依達拉奉組 80 12.55±2.93△ 9.17±2.11＊△▲ 5.18±1.23＊△▲ 2.38±0.56＊△▲

表3 3組血清ENA－78水平比較（±s，ng／L）

表3 3組血清ENA－78水平比較（±s，ng／L）

注：與同組治療前比較，＊P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01；與常規治療組比較，▲P＜0.01

組別 例數 治療前（第1天） 第3天 第7天 第14天對照組 100 30.48±10.79常規治療組 80 279.14±28.16△ 222.33±22.14＊△ 150.39±15.55＊△ 86.09±8.92＊△依達拉奉組 80 276.51±30.20△ 209.06±19.30＊△▲ 103.13±9.52＊△▲ 50.17±4.63＊△▲

表4 3組血清S100β水平比較（±s，ng／L）

表4 3組血清S100β水平比較（±s，ng／L）

注：與同組治療前比較，＊P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01；與常規治療組比較，▲P＜0.01

組別 例數 治療前（第1天） 第3天 第7天 第14天對照組 100 0.97±0.43常規治療組 80 5.76±0.56△ 4.83±0.92＊△ 3.06±0.31＊△ 1.68±0.17＊△依達拉奉組 80 5.86±0.61△ 4.37±0.44＊△▲ 2.07±0.21＊△▲ 1.15±0.12＊△▲

表5 常規治療組和依達拉奉組SSS評分的比較（±s，分）

表5 常規治療組和依達拉奉組SSS評分的比較（±s，分）

注：與同組治療前比較，＊P＜0.01；與常規治療組比較，△P＜0.01

組別 例數 治療前 治療后第1周 治療后第2周 治療后第3周常規治療組 80 31.44±6.70 22.64±4.82＊ 26.44±5.63＊ 36.47±7.77＊依達拉奉組 80 32.24±6.15 22.89±4.37＊ 31.24±5.97△ 40.30±7.6 9＊△

表6 常規治療組和依達拉奉組ADL評分的比較（±s，分）

表6 常規治療組和依達拉奉組ADL評分的比較（±s，分）

注：與同組治療前比較，＊P＜0.01；與常規治療組比較，△P＜0.01

組別 例數 治療前 治療后第1周 治療后第2周 治療后第3周常規治療組 80 32.21±6.33 27.06±5.32＊ 29.31±5.76＊ 35.11±6.90＊依達拉奉組 80 33.76±6.26 28.36±5.26＊ 32.75±6.07△ 41.53±7.70＊△

2.4 相關性分析 直線相關分析顯示治療前腦出血患者（依達拉奉組和常規組）血清S－100β蛋白水平與SSS、ADL評分均呈負相關（分別r＝－0.968，r＝－0.959，P均＜0.01），血清HMGB1 水平與ENA－78水平呈顯著正相關（r＝0.788，P＜0.01）。

3 討 論

出血性腦損傷是一個多因素、多機制、多環節的惡性級聯反應過程，已研究證實炎性反應參與了急性腦出血后繼發性腦損傷的整個過程［1，2］。S－100β蛋白是中樞神經系統的一種特異性酸性鈣結合蛋白，主要由神經膠質細胞合成和分泌。在生理狀態下S100β蛋白以低濃度形式存在，它參與神經細胞的再生與修復，可促進神經生長，調節細胞內外能量代謝，并參與細胞內信號通路傳導，具有神經營養作用；但在病理狀態下高濃度存在的S100β蛋白能夠刺激神經膠質細胞產生大量致炎因子和一氧化氮，并通過一氧化氮依賴途徑導致神經元功能障礙或神經元細胞程序性死亡，具有直接的神經毒性作用［3－5］。腦出血后神經膠質細胞大量壞死、部分細胞活化，S100β蛋白釋放和合成增多，從而出現外周血或腦脊液中S100β蛋白水平升高，而繼之出現的腦水腫、血腦屏障破壞則進一步加重了神經組織損傷，最終誘導了細胞死亡或凋亡［6］。本研究治療前、常規治療組和依達拉奉組患者血清S100β水平均明顯高于對照組，且于發病第1d達高峰，繼之出現緩慢下降，與國外研究結果基本一致［1，7］。治療前腦出血患者（依達拉奉組和常規組）血清S－100β蛋白水平與SSS、ADL 評分均呈負相關，提示血清S－100β蛋白可作為判斷急性腦出血神經功能缺損程度的有效血清學指標［8］。

高遷移率族蛋白－1（HMGB1）是一種DNA 結合蛋白，它廣泛分布于多種組織器官細胞（如淋巴組織、腦、肝、肺等）的胞核和胞漿中，是判斷某些細胞凋亡或壞死的一個關鍵信號，也是迄今為止所發現的惟一的能在細胞外誘導細胞因子分泌和活化炎癥細胞的核內蛋白［9－11］。HMGB1作為一種重要的晚期炎癥介質和致炎細胞因子［12］，參與了組織損傷后修復及多種炎性疾病的病理生理過程［13－16］，它作為啟動和維持炎癥瀑布式反應的中心分子，在致炎因子TNF－α或IL－1等的刺激下單核－巨噬細胞釋放HMGB1，反過來HMGB1也可刺激單核－巨噬細胞分泌TNF－α，L－6，IL－8 等炎癥介質，這樣就形成了一個正反饋環路［17－20］。此外，HMGB1還可以刺激中性粒細胞產生趨化現象，增加上皮細胞的通透性，從而加重局部滲出和水腫，它還可能參與炎癥過程中免疫和內分泌反應的調節［21］。因而，HMGB1可作為感染、損傷后炎性反應藥物治療作用的靶點［22］。

本研究入院后第1 d，依達拉奉組和常規治療組血清HMGB1水平均明顯高于對照組，且達高峰，繼之出現緩慢下降。分析其可能機制為腦出血后血腫周邊腦組織存在缺血和缺氧，導致細胞功能受損、壞死后，炎性細胞大量被激活，炎癥介質釋放入血，產生全身性的瀑布樣炎癥反應［23］，繼而誘發了星形膠質細胞或神經元細胞釋放HMGB1，而后者可刺激星形膠質細胞或神經元細胞釋放MMP－9，IL－1和TNF－α等多種炎性因子［24］。如此反復，形成一個正反饋環路，進而導致血清中HMGB－1可在短時間內迅速增加，隨著炎性反應的逐漸減弱，血清HMGB－1水平緩慢下降。有學者研究表明，血清HMGB－1水平可作為預測動脈瘤所致蛛網膜下腔出血患者臨床神經功能預后和病死率的有利的補充工具［25］。本研究表明，HMGB1在腦出血急性期神經血管單元中擔當起調節炎性反應的早期致炎因子作用［26］。最近一項研究表明，在腦出血的恢復期HMGB1可促進血腫周圍新生血管形成和神經再生［27］。可見，在腦出血不同時期HMGB1具有雙刃劍的作用。

中性粒細胞激活肽－78（ENA－78）由78 個氨基酸組成［28］，結構上與IL－8相似，同屬于C－X－C亞族的趨化因子，在各種炎性介質如脂多糖（LPS）、IL－1、TNF－α等的誘導下均可表達，可由單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞等合成和釋放，但其主要來源為活化的巨噬細胞［29］。ENA－78 具有趨化和激活中性粒細胞作用，它既是炎癥反應的重要介質，又是重要的血管增生因子［30］。ENA－78和IL－8均可與細胞表面特異性受體CXCR－2結合，上調粘附分子E選擇蛋白和CD11b／CD18（Mac 1）的表達，促進白細胞附壁以及從毛細血管及微靜脈滲出，延遲中性粒細胞的凋亡，并刺激白細胞分泌一些生長因子與細胞因子［31］。已有研究證實，ENA－78活性的增加與微血管通透性、炎性細胞侵入和水腫明顯相關［32］。

本研究發病后第1 d，依達拉奉組和常規治療組血清ENA－78水平均明顯高于對照組，且達高峰，繼之出現緩慢下降。經直線相關分析提示，血清HMGB1水平與ENA－78水平呈顯著正相關，分析其可能機制為腦出血后血腫周邊腦組織缺血缺氧后導致細胞損傷、壞死，大量炎性細胞浸潤，后者合成和釋放ENA－78；與此同時，星形膠質細胞或神經元細胞釋放HMGB1增加［33］，HMGB1反過來刺激星形膠質細胞或神經元細胞釋放多種炎性因子如TNF－α等，并可特征性的上調白細胞粘附分子（ICAM－1和VCAM－1），分泌中性粒細胞和內皮細胞化學趨化素（IL－8 和MCP－1）等［34］，而TNF－α是關鍵的早期炎癥介質，具有調節和放大炎癥反應的作用，隨著血清TNF－α水平的升高，炎性細胞浸潤亦增加，炎性反應進一步增強。因而，ENA－78 和HMGB1二者互為因果關系。本研究結果顯示，血清ENA－78 和HMGB1 均可能參與了腦出血急性期繼發性炎性反應過程［35］。

腦出血后繼發的病理生理變化是復雜多樣的，早期血腫占位效應造成的周邊腦組織缺血、缺氧以及病灶部位白細胞浸潤可產生大量自由基，其后紅細胞大量降解生成的血紅蛋白、活性鐵也產生大量自由基，后者可造成血管內皮細胞功能受損，從而使腦血管通透性增加，腦水腫加重，并在此過程中產生新的自由基形成連鎖反應，造成更嚴重的腦損害。已有研究證實自由基的產生在腦出血后細胞凋亡中發揮著重要作用，自由基的水平上升可促進神經元細胞和神經膠質細胞凋亡［36］。依達拉奉是一種相對分子質量小的自由基清除劑，具有親脂基團，對血－腦屏障的通透率較高，靜脈給藥后可以很容易地到達作用部位，清除腦內的毒性自由基，并且通過打斷脂質過氧化反應鏈來抑制腦細胞（血管內皮細胞、神經細胞、神經膠質細胞）膜的過氧化反應，保持了腦細胞膜結構和功能的完整性，從而有效地抑制了遲發性神經元死亡。在一項動物實驗的研究中發現，采用依達拉奉干預治療可有效地減輕腦出血模型大鼠血腫周邊水腫帶面積，降低神經功能缺失評分，促進神經功能恢復［37］。

本研究治療后第2周和第3周依達拉奉組患者SSS和ADL評分明顯高于常規治療組患者，提示依達拉奉作為新型自由基清除劑能明顯改善腦卒中所致的神經功能障礙，而且在發病后第3d、第7d和第14d依達拉奉組血清HMGB1、ENA－78和S100β水平均明顯低于常規治療組，提示依達拉奉可通過有效地降低腦出血患者急性期血清HMGB1、ENA－78和S100β水平來減輕腦出血后繼發炎性反應。本研究推測其可能作用機制為依達拉奉可能是通過清除自由基和抑制脂質過氧化，穩定神經元細胞膜，減少S－100β蛋白漏出，與此同時由于腦細胞膜結構和功能的完整性得以保持，有效地抑制了遲發性神經元死亡，星形膠質細胞或神經元細胞釋放HMGB1的含量降低，從而減輕了神經元死亡后繼發的炎性反應，炎性反應介質如TNF－α等釋放減少，從而減少了對ENA－78的誘導產生。當然，其具體作用機制十分復雜，后期研究中將更深入一步進行探討。

有關腦出血的腦保護治療仍然是臨床工作中的重點和難點，如何利用藥物減輕繼發性的炎性反應和促進神經功能的恢復仍然是核心和關鍵問題。綜上所述，血清S－100β濃度可作為評估腦出血后腦損傷嚴重程度的血清學指標，血清HMGB1和ENA－78可能參與了腦出血后繼發炎性反應過程。依達拉奉作為一種強有效的腦保護劑，具有減輕腦出血后炎癥反應、保護腦細胞和提高患者神經功能的作用。因此，依達拉奉不失為腦出血患者急性期治療中的一種良好的可選藥物，由于腦出血后繼發炎性反應的病理生理機制相當復雜，因此在后期的研究中，將進一步推廣和擴大樣本量研究，并深入探討依達拉奉對腦出血的可能腦保護作用機制。

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