巴馬地區壯族人群口腔黏膜細胞端粒的長度

羅曉秋 吳華裕 劉承武 彭均華 羅 桓 尹瑞興 呂澤平 潘尚領

(廣西醫科大學病理生理學教研室，廣西 南寧 530021)

端粒是真核細胞染色體末端的“帽狀”非編碼結構，由不同拷貝數的DNA重復序列和一些特殊的核蛋白組成。不同物種端粒長度(TL)差異較大，一般從50 bp到50 kb。即使是同一物種，不同個體之間或同一個體的不同組織之間，其端粒長短亦不相同。人類體細胞的端粒重復序列是(TTAGGG)n，其長度約5～15 kb，其中，人精子端粒長約15 kb，外周血白細胞端粒長約10 kb〔1〕。端粒的主要功能是維持染色體的穩定性和完整性。然而，隨著細胞分裂、傳代次數的增加，TL的縮短不可避免地超過某個域值，最終失去對染色體的保護作用而引發細胞衰老、凋亡或細胞的永生化及腫瘤發生〔1〕。TL也作為一個可量化的性狀，被認為是細胞復制性衰老的計時器〔2〕，并逐漸被當作一些疾病或表型的生物學標記〔3，4〕。本研究通過應用熒光定量PCR的方法對世界第五長壽之鄉——廣西巴馬地區的壯族長壽老人、其第一代子女及該地區與長壽老人無血緣關系且年齡、性別與第一代子女相匹配的健康壯族普通人進行口腔黏膜脫落上皮細胞的相對端粒長度(RTL)的測定，探討TL隨年齡變化的規律、遺傳趨勢及其與長壽的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 長壽組367名，男106名，女261名，年齡90～104(93.23±2.96)歲。另設兩個對照組：子女組：長壽老人的第一代子女445名，男319名，女126名，年齡39～76(58.12±7.08)歲;對照組：與子女組年齡、性別相匹配且與長壽老人無血緣關系的本地普通壯族人群175名，男128名，女47名，年齡38～79(58.77±10.14)歲，見表1。長壽老人為調查時居住在廣西巴馬地區(東蘭、巴馬、鳳山及都安四縣)年齡≥90歲的老人，對照組為家中三代內無≥90歲老人且與長壽老人無任何血緣關系的普通人群。所有研究對象均為壯族，生活習慣及勞動條件基本相同。所有受檢者在采樣之前接受問診、認知、自理能力測試，排除心、腦血管病、糖尿病、老年癡呆癥等老年相關性疾病，基本上屬于健康受試對象。

表1 三組不同年齡段組成(n)

1.2 標本的采集與處理 每個受試對象在采樣前常規漱口，繼之漱以生理鹽水，然后用棉拭子刮取口腔左側頰部黏膜30次，用裝有1 ml生理鹽水的離心管存放刮取物，凍存備用。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA的提取 將凍存的口腔脫落上皮細胞用蛋白酶K進行消化，過夜后用經典苯/氯仿法提取DNA，-20℃保存。

1.3.2 端粒長度測定 參照文獻〔5〕，使用實時熒光定量PCR方法進行口腔脫落上皮細胞相對端粒長度的測定，主要步驟如下：①引物序列：由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。端粒的引物：上游：5'ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT 3'，下游：5'TGTTAGGTATCCCTATCCCT ATCCCTATCCCTATCCCTAACA 3';內參36B4基因的引物：上游：5'CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 3'，下游：5'CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 3';②端粒與內參36B4基因Ct值的測定：端粒與內參36B4基因的擴增在不同的96孔板中進行，每個96孔板均含一個相同的參照樣品。反應體系均為20 μl，其中Mix(Roche產品)均為10 μl，DNA模板均為50 ng，端粒上下游引物終濃度均為0.8 μmol/L，36B4基因上下游引物終濃度均為0.4 μmol/L，其余體積用雙蒸水補足。端粒的反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，49℃ 1 min，進行 2 個循環，然后，95℃ 15 s，62℃ 1 min，72℃ 20 s，進行40 個循環并在 72℃收集熒光。36B4基因的反應條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃1 min，40個循環，60℃收集熒光，反應結束繪制熔解曲線。

1.3.3 T/S比率的計算 采用real-time PCR儀配套軟件，分別確定端粒反應及內參36B4基因反應的 Ct值-Ct及 Ct(36B4)，根據PCR反應產物以2的指數倍遞增原理，T/S比率接近于公式〔2Ct(telomeres)/2Ct(36B4)〕-1=2-△Ct。為消取每個96孔板間的誤差而選用參照樣品作為陽性對照，RTL即為相對T/S值=2-△Ct(待測樣品)/2-△Ct(參照樣品)。

1.4 統計學處理 用統計軟件SPSS13.0進行分析，各組之間RTL的中位數差異用兩個獨立樣本的Wilcoxon秩和檢驗;RTL與年齡的關系用Spearson相關、偏相關進行統計分析。

2 結果

2.1 TL的遺傳 將對照組與長壽組組合成年齡從38～104歲且個體間無血緣關系的普通群體，其RTL與年齡的相關系數為(R=-0.102，P=0.018);將子女組與長壽組組合成年齡從39～104歲有血緣關系的長壽群體，其RTL與年齡的相關系數為(R=-0.026，P=0.461)，表明TL的維持在長壽群體中更優越。子女組與對照組在較低年齡段(＜65歲年齡段)RTL雖無顯著差異，但子女組中較高年齡段(65歲～年齡段)的RTL明顯長于同年齡段的對照組(P=0.026)，同時，長壽組(90歲～年齡段)的RTL與對照組高年齡段(65～年齡段)的RTL相當(1.662～1.709，P=0.755)，提示長壽群體中特別到了65歲以后端粒的縮短速率明顯減慢。見表2。

表2 長壽組、子女組、對照組不同年齡段的RTL〔中位值(范圍)〕

2.2 TL與年齡 以年齡為橫坐標，口腔上皮脫落細胞 RTL為縱坐標，繪制散點圖。因不同組別及性別間端粒長度存在差異，所以以組別和性別為控制變量，應用偏相關分析。總體的RTL與年齡的相關系數為(R=-0.109，P=0.001);控制組別后，總體男性的RTL與年齡的相關系數為(R=-0.121，P=0.005)，女性為(R=-0.091，P=0.059)。這些結果表明，在研究人群中，口腔黏膜細胞RTL隨著年齡的增大而縮短，這種變化在男性中也存在但在女性中沒有顯示出來。

2.3 TL與性別 總體人群、組合人群及不同組別各年齡段男、女之間的RTL比較見表3。在長壽組與子女組組合的長壽群體、子女組中，各年齡段男性和女性的 TL均無顯著差別(P＞0.05);對照組的較高年齡段(65～年齡段)顯示男性RTL明顯長于女性(P=0.006)，同時總體人群、長壽組與對照組組合的普通人群在該年齡段也顯示男性RTL明顯長于女性RTL(P總體=0.024，P組合=0.006)，但這均由對照組的性別差異 形成的。

表3 各組別不同年齡段不同性別的RTL〔中位值(范圍)〕

3 討論

口腔黏膜脫落上皮細胞是在體細胞，它的采集方法簡單且相對無侵襲性，特別適用于參與者較多且年齡較大的特殊群體，其衰老在一定程度上可反映機體的衰老過程，因此已被用于人類衰老/長壽的研究。口腔黏膜脫落上皮細胞DNA端粒長度與年齡〔6〕及年齡相關性疾病〔7，8〕的研究目前在國外已有不少報道。端粒是染色體末端的保護結構，它的長度與人類(包括長壽老人)的生命壽限是密切相關的〔9〕，但由于缺乏有效的對照組使許多研究的結果不一致。與Atzmon等〔9〕的研究類似，我們將受試對象分為長壽組、子女組、對照組，其中子女組為長壽老人的第一代子女，對照組為年齡、性別與子女組相匹配且與長壽老人無血緣關系的同一地區具有相同生活背景的普通人群。這種有長壽趨勢的子女組及與子女組相匹配的對照組的選取為長壽表型的研究提供了有效的遺傳學對照。

本研究說明長壽群體的個體在進入一定年齡后(本研究為65歲)TL縮短速率變慢，表明長壽群體對TL的維持可能存在特殊的機制，與Atzmon等〔9〕的研究類似。本研究中子女組在較高年齡段(65歲～年齡段)的RTL明顯長于同年齡段的對照組，而較低年齡段(＜65歲)RTL在子女組與對照組之間無差別，同時，長壽組(90歲～年齡段)的RTL與對照組高年齡段(65歲～年齡段)的RTL相當，進一步說明TL的遺傳性。這可能是生存差異所致高壽者擁有較長的端粒的原因，即各種年齡相關性疾病使端粒較短者死亡而被淘汰出自然人群，因逃避了此類疾病及其所致的端粒縮短而獲得高壽的個體，其端粒較長，再遺傳給子代，使子代也保持了較長的端粒。

Hayflick假說是指細胞分裂能力的有限性，體細胞端粒長度在DNA復制過程中的縮短支持了該假說，端粒的縮短已經被認為是一種生物鐘〔10，11〕。盡管其縮短速率有不同的報道〔10〕，但均隨著年齡的增長而縮短。本研究中，總體人群RTL與年齡呈顯著負相關，即年齡越大，端粒長度越短，與其他學者的結果一致〔12～14〕，再次表明TL與衰老之間的密切關系，或換言之，TL可以當作衰老的生物學標記之一。

本研究的流行病學調查顯示長壽女性(71.1%)的數量遠超于男性，這與 Tabatabaie 等〔15〕、Boyden 等〔16〕進行的長壽群體研究是一致的，表明女性個體在長壽表型中有一定優勢。M¨oller等〔10〕和Njajou等〔17〕報道女性的端粒長于男性，但本研究中長壽組、子女組的女性RTL并不長于男性，雖然流行病學調查顯示，長壽者中女性遠多于男性，但長壽男性和女性之間的TL并無明顯區別，表明除TL的變化對衰老的影響外，高壽的獲得可能源自其他因素。對照組的高年齡段(65～年齡段)出現了男性RTL比女性長(P=0.006)，這可能是由于進入更年期之后女性體內的雌激素水平下降，與日本學者Guan等〔18〕的發現類似。但子女組并沒有出現該現象，可能說明有長壽趨勢的個體體內存在某種對抗雌激素下降的機制而維持女性在65歲年齡之后仍保持較高端粒水平，此問題值得進一步探究。

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