丹參酮ⅡA對兔動脈粥樣硬化病灶凋亡相關基因表達的影響

沈曉君 高愛社 關懷敏 丁淑亞 趙君玫 陳 芳 (河南中醫學院，河南 鄭州 450008)

動脈粥樣硬化(AS)的發病機制至今尚未完全闡明，目前的研究認為血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和遷移是AS的成因之一，因此，促進過度增殖的VSMC凋亡是逆轉AS病變的有效途徑。丹參酮ⅡA是丹參中有效的脂溶性藥理成分之一，研究證實丹參酮ⅡA可抑制AS時VSMC過度增殖，對AS及其所致心腦血管疾病的治療有很高的應用價值〔1〕，本實驗通過差異顯示篩選出與丹參酮ⅡA促進VSMC凋亡相關的葡萄糖調節蛋白78(GRP78)基因片段，觀察該基因在兔正常及AS病變組織中的表達水平，探討丹參酮ⅡA誘導VSMC凋亡可能的機制和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 丹參酮ⅡA對照品購自中國藥品生物制品鑒定所，20 mg/瓶，批號：200619。同型半胱氨酸，Sigma公司產品，25 g/瓶，純度≥98%，批號：C-7352。兔主動脈VSMC由中國協和醫科大學基礎醫學院細胞培養中心提供。雄性日本大耳白兔，體質量1.8～2.0 kg，普通級，5月齡，由河南省科學技術開發交流中心提供，質量合格證號：SCXK(豫2005-00027)。In si-tu Apoptosis Detection Kit，pMD-19T載體，DNA 連接酶，大腸桿菌JM109，限制性內切酶BamHⅠ，限制性內切酶HincⅡ，Taq酶(均為大連寶生物工程有限公司產品)，DMEM(Gibco BRL.USA產品)，高純總RNA快速提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司產品)，逆轉錄試劑盒(Fermentas產品)，抗地高辛標記HRP檢測試劑盒(北京中山生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法細胞增殖能力檢測 細胞按1×108/L密度稀釋后接種于96孔培養板培養24 h后分為空白組、HCY模型組、丹參酮ⅡA處理組，每組設6個復孔。除空白組外，各組均加入同型半胱氨酸，劑量為10－4mol/L，培養24 h后，丹參酮ⅡA處理組分別加入終濃度0.25、0.5、1 mg/L的丹參酮ⅡA，培養48 h后，加入 MTT(5 mg/ml)液 20 μl/孔，繼續培養4 h，去上清，加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，上酶標儀490 nm處測吸光度值。

1.2.2 RT-PCR 參照GenBank公布的GRP78基因cDNA序列，應用RRIMER PREMIER 5.0等分析軟件進行分析后，設計兩對引物。GRP78序列引物，上游：5-TCT AGG TGAACGACCCCTAAC-3，下游：5-GTTCTCTCAATTTTCTCCCAAC-3;β-actin引物設計，上游引物：5'-CTACAATGAGCTGGTGTGG-3'，下游引物：5'-TAGCTCTTCTTCAGGGAGGA-3'。提取每組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，以β-actin為內參照，擴增GRP78基因，回收各組表達明顯差異的基因片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel Doc200TM型凝膠圖像分析儀進行吸光度掃描，觀察條帶的灰度強弱，結果以目的基因與β-actin的積分吸光度比值表示。

1.2.3 克隆差異表達基因片段、酶切鑒定并測序 PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切下目的片段，瓊脂糖凝膠回收，目的片段與質粒pMD19-T載體的重組連接、連接產物轉化大腸桿菌JM109、感受態的制備和轉化方法參照分子克隆第三版進行。取少許菌落，菌液PCR擴增，產物瓊脂糖凝膠電泳分析，進行重組質粒的篩選，用限制性內切酶BamHⅠ單酶切，BamHⅠ和HincⅡ雙酶切重組質粒pMD-19T-GRP，鑒定、測序。

1.2.4 復制AS動物模型 12只雄性日本大耳白兔，體質量1.8～2.2 kg，隨機分為高脂組和正常組，每組6只。正常組飼喂普通飼料，高脂組在普通飼料中加入1%膽固醇及0.02%蛋氨酸，單籠喂養。飼喂9 w后，開胸快速截取胸主動脈上段，迅速至液氮罐中(-196℃)中保存。

1.2.5 制備地高辛標記探針 采用質粒提取純化試劑盒進行質粒DNA小量制備及純化，直接擴增目的基因片段，抗地高辛標記HRP檢測試劑盒標記。在硝酸纖維素膜點樣檢測探針，放入80℃烤箱中固定2 h，放入15～25℃馬來酸緩沖液中洗2 min，分別在阻斷溶液、抗體溶液中輕搖30 min，用洗滌緩沖液洗2次，每次15 min，放入顯色溶液中，暗處靜置孵育30 min。條帶出現后，TE緩沖液洗滌以終止反應。

1.2.6 組織原位雜交 兔胸主動脈常規脫水、浸蠟、包埋，切片厚度6～8 μm。使用1 μg/ml蛋白酶 K(0.1 mol/L Tris HCl緩沖液配制，pH8.0)，37℃孵育10 min，PBS洗滌，暴露 cDNA核酸片段。1%多聚甲醛后固定，預雜交。每張切片加20 μl探針雜交液，將原位雜交專用蓋玻片保護膜蓋在切片上，恒溫箱中95℃ 10 min使DNA變性，38～42℃雜交過夜。洗滌，滴加蛋白封閉緩沖液，再滴加兔抗地高辛-BSA，37℃ 60 min，PBS洗滌。滴加HRP-羊抗兔 IgG，37℃ 30 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復染，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對VSMC增殖能力的影響 與空白組相比較，模型組OD值顯著升高(P＜0.01)，證明HCY可促進VSMC增殖，實驗造模成功;與模型組相比，高、中、低濃度的丹參酮ⅡA都可抑制HCY所誘導的VSMC增殖(P＜0.05)，抑制作用與丹參酮ⅡA濃度呈正相關。見表1。

2.2 GRP78 mRNA表達 RT-PCR半定量檢測顯示丹參酮ⅡA處理組細胞GRP78 mRNA有明顯表達，與模型組比較差異顯著(P ＜0.05)，見表1。

2.3 差異表達基因片段測序結果 全長648 bp的基因片段與兔GRP78基因高度同源。

2.4 組織原位雜交 兔主動脈石蠟切片、HE染色見正常組血管內皮細胞完整，中膜VSMC排列整齊;高脂組血管內皮細胞脫落，中膜VSMC增生，并見大量膠原纖維形成，見圖1。組織原位雜交高脂組與正常組主動脈VSMC胞質中均可見棕黃色顆粒表達，并有核周聚集現象，表明探針與VSMC胞質中的GRP78 mRNA結合。高脂組與正常組比較，聚集顆粒明顯增多，表明高脂組家兔VSMC GRP78基因表達水平高于正常組，見圖2。

表1 丹參酮ⅡA對兔VSMC增殖能力及GRP78 mRNA表達的影響( s ，n=6)

表1 丹參酮ⅡA對兔VSMC增殖能力及GRP78 mRNA表達的影響( s ，n=6)

與空白組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.05

－ 0.68±0.03 0.103±0.041模型組 10－4mol/L 0.89±0.061) 0.275±0.0351)丹參酮ⅡA 0.25 mg/L 0.78±0.042) 0.338±0.0332)0.5 mg/L 0.76±0.032) 0.349±0.0262)1 mg/L 0.75±0.052) 0.382±0.0292)-actin mRNA空白組組別 濃度 OD值(490 nm)GRP78mRNA/β

圖1 兔主動脈組織切片(HE，×100)

圖2 組織原位雜交檢測主動脈VSMC GRP78 mRNA陽性表達信號(×100)

3 討論

AS時動脈中膜的VSMC遷入內皮下間隙并增生，部分VSMC攝取脂質轉化為肌源性泡沫細胞，與巨噬細胞源性泡沫細胞在動脈內膜聚集，形成脂質條紋等AS早期病變。VSMC還可由收縮型轉化為合成型，產生大量細胞外基質組成纖維帽，纖維斑塊中的泡沫細胞進一步壞死崩解，形成粥樣斑塊等AS典型病變。因此，抑制VSMC的增殖可能成為治療動脈粥樣硬化等心血管疾病的主要策略之一〔2〕。

近年來，內質網應激(ERS)在冠心病不穩定斑塊形成中的重要作用受到廣泛關注〔3〕。ERS作為細胞水平的應激將AS形成的細胞機制與多種危險因素聯系起來，并貫穿于其發展的整個過程〔4，5〕。熱休克蛋白(Hsp)是應激情況下細胞新合成或合成增加的一組蛋白質，從原核細胞到真核細胞的各種生物體，其同類型的Hsp基因序列有高度同源性，其功能涉及細胞的結構維持、更新、修復、免疫等，對于維持細胞生命具有重要意義。GRP78是Hsp70家族的成員之一，蛋白在內質網腔形成空間結構由許多分子伴侶蛋白協助，GRP78與新生多肽以非共價鍵形式短暫結合以促進蛋白質的正確折疊，是內質網中最重要的分子伴侶之一。GRP78在應激反應調節時其基因的轉錄活性可顯著提高，被認為是ERS的一種標志蛋白〔6〕。GRP78的表達是細胞的一種適應性保護反應，但是隨著應激反應的演進，過度的ERS可激活下游的凋亡信號分子，促使細胞發生凋亡，由此可見，ERS是存活程序和凋亡程序同時被激活的過程〔7〕。Croons等〔8〕對體外培養的VSMC給予嘌呤霉素后出現細胞凋亡，同時檢測到內質網應激信號蛋白表達;給予內質網應激阻斷劑放線菌酮可以部分減少VSMC凋亡，證明VSMC凋亡機制有RES的參與。

作為單體的丹參酮ⅡA具有抗心律失常、抗心肌肥厚和缺血，改善內皮功能等多種心腦血管系統藥效作用。研究發現丹參酮ⅡA可通過下調鈣調神經磷酸酶活性和抑制鈣調神經磷酸酶mRNA表達、阻止大鼠VSMC細胞周期由G0/G1期向S期推進、引起細胞外信號調節激酶磷酸化活性降低，c-fos表達水平降低而抑制VSMC增殖〔9，10〕。近年來丹參酮ⅡA對心臟和血管影響的研究有了更深層次的發展，但其通過上調GRP78等內質網應激蛋白基因使凋亡信號放大，誘導過度增殖的VSMC凋亡的研究報道甚少。

本實驗表明GRP78基因參與AS病變過程;該基因片段定位于VSMC胞質，提示ERS可能是AS時VSMC增殖失控的機制之一。本研究差異篩選出GRP78基因片段，組織原位雜交證實其來源于兔VSMC并與丹參酮ⅡA誘導的細胞凋亡有關，提示該基因可能是丹參酮ⅡA作用靶點之一。在丹參酮ⅡA誘導VSMC凋亡的同時GRP78基因高表達，提示過度的ERS促進VSMC凋亡。但丹參酮ⅡA調控GRP78表達、啟動細胞凋亡的途徑還有待于進一步的研究。

1 李 欣，杜俊蓉，白 波，等.丹參酮ⅡA抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖及其機制研究〔J〕.中國中藥雜志，2008;33(17)：2146-50.

2 鐘芝茵，周 喆，邢雅玲，等.丹參酮ⅡA、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1配伍對平滑肌細胞的抑制作用〔J〕.軍事醫學科學院院刊，2008;32(4)：340-3.

3 王 旭.內質網應激與動脈粥樣硬化研究進展〔J〕.中國動脈硬化雜志，2009;17(4)：323-6.

4 Semion T，Tabas I.Mechanisms and consequences of macrophage apoptosis in atherosclerosis〔J〕.J Lipid Res，2009;50(Suppl)：382-7.

5 Dickhout JG，Colgan SM，Lhotak S，et al.Austin increased endoplasmic reticulum stress in atherosclerotic plaques associated with acute coronary syndrome：a balancing act between plaque stability and rupture〔J〕.Circulation，2007;116(11)：1214-6.

6 沈曉君，何 航.淫羊藿苷對HCY誘導增殖血管平滑肌細胞GRP78表達的影響〔J〕.中國中藥雜志，2009;34(15)：1964-7.

7 楊麗霞，沈珠甫，郭瑞威，等.Bcl-2在神經酰胺致人臍靜脈內皮細胞凋亡中的作用〔J〕.中國動脈硬化雜志，2008;16(2)：132-5.

8 Croons V，Martinet W，Herman AG.Differential effect of the protein synthesis inhibitors puromycin and cycloheximide on vascular smooth muscle cell viability〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2008;325(3)：824-32.

9 潘勇軍，李曉勇，楊光田.丹參酮ⅡA對增殖的大鼠血管平滑肌細胞中鈣調神經磷酸酶活性的影響〔J〕.中國中西醫結合雜志，2009;29(2)：133-5.

10 李 欣，杜俊蓉，白 波，等.丹參酮ⅡA抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖及其機制研究〔J〕.中國中藥雜志，2008;33(17)：2146-50.