吳茱萸堿對S180荷瘤小鼠抑瘤作用及血常規的影響

李立宏 蔣麗娜 石永威 張曉麗 孫 黎 羅 強 賈天軍 (河北北方學院，河北 張家口 075000)

吳茱萸堿是傳統中藥吳茱萸的主要生物堿之一。近來發現吳茱萸堿有很強的抗腫瘤作用，體外實驗發現吳茱萸堿可抑制人乳腺癌細胞〔1〕、前列腺腫瘤細胞〔2〕、小鼠肝癌細胞〔3〕、人胃癌細胞〔4〕、人白血病細胞〔5〕等的腫瘤細胞株，并誘導腫瘤細胞凋亡，能抑制腫瘤血管生成及浸潤轉移。有關吳茱萸堿在動物整體抗腫瘤方面的研究很少見到。本實驗觀察了吳茱萸堿對S180荷瘤小鼠的抑瘤作用，以及對血細胞的影響，為吳茱萸堿的開發利用提供實驗依據。在實驗動物模型基礎上進行整體研究，進一步探討吳茱萸堿體內的抑瘤作用及其抑瘤機制，這既是全面、客觀評價吳茱萸堿抗腫瘤作用的需要，也是將來應用于臨床之前所必需提供的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 吳茱萸堿均購自南京澤郎醫藥科技有限公司(批號：ZL081012GC)。注射用環磷酰胺(200 mg/支，批號：06112020)，購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細胞由河北醫科大學實驗動物部提供，本院實驗中心凍存。昆明小鼠，體重18～22 g，清潔級，購自北京大學醫學部實驗動物室。BC-2000血液分析儀(深圳邁瑞公司)及配套試劑。

1.2 小鼠S180肉瘤移植瘤模型建立 小鼠肉瘤S180腹水型腫瘤細胞株接種于小鼠腹腔，7 d后，脫頸椎處死，置于75%的乙醇浸泡5 min消毒，無菌抽取腹水瘤細胞，調整細胞濃度為1.3×107/ml，于昆明種小鼠左后肢行無菌皮下接種0.2 ml細胞懸液，于30 min內接種完成。接種后第6天全部出現瘤塊，小鼠移植瘤模型全部成功。

1.3 實驗動物分組及處理 接種后將小鼠按體重隨機分為3組：模型組(0.5%羧甲基纖維素鈉，劑量10 ml/kg)、陽性對照組(給予環磷酰胺，劑量50 mg/kg)、吳茱萸堿組(給予吳茱萸堿，劑量50 mg/kg)。每組小鼠10只，雌雄各半。接種后第6天，腫瘤模型組和吳茱萸堿組每日灌胃一次，連續12次，陽性對照組隔日給藥一次，腹腔注射，連續6次。于停藥當日從尾部采集血液，于2 h內測試完畢。停藥后次日處死。

1.4 實驗指標 每日觀察各組實驗動物的生長情況。停藥后次日，處死全部動物，剝取瘤塊，稱重，按公式計算抑瘤率。各組瘤體組織標本常規固定，脫水，透明，包埋，切片，HE染色觀察。于停藥當日從尾部采集血液20 μl，預稀釋后于2 h內測試完畢。按照儀器說明書操作，使用配套試劑，測試前先做室內質控，保證儀器質控狀態良好。

2 結果

2.1 實驗動物生長情況 結果顯示，昆明小鼠接種S180后，模型組小鼠進食量明顯減少，精神狀態較差，行動欠靈活，皮毛發澀。而吳茱萸堿給藥組的小鼠，其進食量及運動狀態均好于模型組，皮毛順滑;在吳茱萸堿組，有1只小鼠的腫物出現明顯的破皮結痂現象。

2.2 吳茱萸堿對小鼠S180肉瘤腫瘤模型生長的抑制作用。見表1。吳茱萸堿對腫瘤抑制率43.6%，且抑制率與模型對照組比較有統計學差異(P＜0.01)，說明吳茱萸堿在體內有較強的抗腫瘤作用。

表1 吳茱萸堿對小鼠S180肉瘤腫瘤模型生長的抑制作用(n=10)

2.3 小鼠S180肉瘤組織病理學變化 HE染色，顯微鏡觀察。腫瘤模型組腫瘤細胞生長旺盛，腫瘤細胞大小不一，胞核有明顯異型性，可見瘤組織呈巢狀或片狀生長，壞死不明顯，片狀壞死區面積較小，可見癌巢間微血管較豐富，周圍有程度不等的炎性細胞浸潤。環磷酰胺組有大片的腫瘤細胞壞死區，甚至80%～90%的區域壞死，瘤組織呈片狀或團狀生長。吳茱萸堿組均可見不同程度的片狀壞死區域，瘤組織內的微血管減少，周圍有程度不等的炎性細胞浸潤。

2.4 吳茱萸堿對S180肉瘤荷瘤小鼠外周血血常規的影響見表2。吳茱萸堿(劑量50 mg/kg)能升高S180荷瘤小鼠外周血的白細胞(P＜0.05)，對其他血細胞(紅細胞和血小板)的影響不大。

表2 吳茱萸堿對S180肉瘤荷瘤小鼠外周血血常規的影響( s ，n=10)

表2 吳茱萸堿對S180肉瘤荷瘤小鼠外周血血常規的影響( s ，n=10)

與模型組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 白細胞(×109/L)血小板(×109/L)紅細胞(×1012/L)血紅蛋白(g/L)±23.10陽性對照組 7.40±2.252)1 071.75±315.94 6.90±1.44 125.20±21.44吳茱萸堿組19.45±4.751)模型組 15.19±4.51 1 315.00±120.91 7.67±1.53 130.50 1 077.70±175.14 8.80±1.69 152.60±29.00

3 討論

目前，臨床使用的抗腫瘤藥物大多存在毒副作用強、對機體損害大的不良反應，尋求安全有效、低毒的抗腫瘤藥物一直受到國內外醫藥界專家學者的高度重視。最近發現吳茱萸堿有很強的抗腫瘤作用，但這些報導多為體外抗腫瘤作用研究，有關其在動物整體抗腫瘤方面的研究少見報道。本實驗顯示吳茱萸堿作用于S180荷瘤小鼠的抑瘤率為43.6%，抑制作用較強，但不及環磷酰胺的抑瘤作用，吳茱萸堿作為抗腫瘤藥有較大的開發潛力。宋穎等〔6〕也研究了吳茱萸堿對小鼠肉瘤S180和小鼠肝癌腹水型HepA的影響，小鼠左腋部皮下分別接種S180和HepA，灌胃給藥，連續給藥10 d，結果顯示吳茱萸堿對S180和 HepA的生長均具有明顯的抑制作用，20、10和5 mg/kg吳茱萸堿，可使抑瘤率達到30% ～60%左右。

眾所周知，環磷酰胺在臨床應用中的副作用明顯，主要表現為骨髓抑制，導致白細胞和血小板減少以及貧血。本文也觀察到陽性對照組的白細胞數量明顯低于腫瘤模型組，而吳茱萸堿對S180荷瘤小鼠外周血的白細胞數不但無降低作用，而且有升高作用。提示吳茱萸堿抗腫瘤作用機制之一可能是通過增加荷瘤小鼠外周血白細胞的數量，從而抑制腫瘤的生長，達到抗腫瘤的目的。宋朝陽等〔7〕將8周齡雄性C57BL/6小鼠處死，取胸腺、脾組織研磨過濾為單細胞懸液，MTT顯示當濃度≥0.5 μmol/L時，吳茱萸堿在24、48和72 h均明顯抑制ConA誘導的小鼠胸腺、脾淋巴細胞增殖;吳茱萸堿處理的小鼠脾和胸腺細胞釋放IL-2、IL-12的功能較對照組明顯減低。因此，需進一步研究吳茱萸堿對荷瘤小鼠免疫能力的影響，以及吳茱萸堿與環磷酰胺聯合應用，能否對抗環磷酰胺引起的白細胞數下降，從而達到減毒增效作用。

1 Liao CH，Pan SL，Guh JH，et al.Antitumor mechanism of evodiamine a constituent from Chinese herb Evodiae fructus in human multiple-drug resistant breast NCI/ADR-RES cells in vitro and in vivo〔J〕.Carcinogen-esis，2005;26(5)：968-75.

2 Huang DM，Guh JH，Huang YT，et al.Induction of mitotic arrest and apoptosis in human prostate cancer pc-3 cells by evodiamine〔J〕.J Urol，2005;173(1)：256-61.

3 譚宇蕙，吳映雅，鐘富有，等.吳茱萸堿對小鼠肝癌細胞生長的抑制和誘導凋亡作用〔J〕.中國藥理與臨床，2006;22(3-4)：33-5.

4 譚宇蕙，陳蔚文，吳映雅，等.小檗堿、吳茱萸堿和靛玉紅對人胃癌細胞的作用比較〔J〕.世界華人消化雜志，2005;13(4)：472-6.

5 Lee TJ，Kim EJ，Kim S，et al.Caspase-dependent and caspase-independent apoptosis induced by evodiamine in human leukemic U937 cells〔J〕.Mol Cancer Ther，2006;5(9)：2398-407.

6 宋 穎，趙文杰，宋 宇，等.吳茱萸堿體內抗腫瘤作用研究〔J〕.吉林中醫藥，2008;28(12)：934-6.

7 宋朝陽，鄧 蘭，胡海燕，等.吳茱萸堿對小鼠免疫功能的調節作用〔J〕. 中藥材，2008;31(6)：885-8.