慢性鋁過負荷對大鼠的肝損傷作用

雷文娟 何 琴 余麗娟 郭遠新 王健峰 潘永全 羅 映 余華榮 楊俊卿

(重慶醫科大學藥理教研室，重慶 400016)

鋁廣泛存在環境的土壤、水和空氣中，也是人們生活中運用最廣的金屬〔1〕。金屬鋁存在于玉米、黃色的奶酪、鹽、草藥、茶葉、香料、瓷器和容器中，也用作藥品添加劑和飲用水純化劑〔2〕，因此，人們不可避免頻繁接觸鋁。考慮到機體鋁的蓄積，歐洲食品安全局在2008年制定了每周食物鋁攝入的最大耐受標準，并認為歐洲一些國家的普通人群食物鋁攝入已超過該標準〔3〕，然而直到1975年第1例鋁相關性腦病的報道，鋁的組織器官毒性才引起學者重視〔4〕。現有研究表明，鋁可引起腎毒性、骨毒性、肺毒性、心毒性和神經毒性〔5，6〕，肝是金屬離子容易蓄積的臟器，鋁在肝臟的累積可能比腦等組織更明顯〔1〕。鋁主要蓄積在肝的巨噬細胞和溶酶體等細胞器〔7〕，但是長期接觸鋁特別是某些職業工人的肝毒性并沒有引起足夠的重視〔8〕。本研究采用大鼠慢性口服給鋁的方式，觀察鋁負荷大鼠的肝功能和形態學改變，并初步探討其機制，為長期鋁接觸的肝毒性臨床研究提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物與主要試劑 雄性清潔級Wistar大鼠24只，質量220～250 g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證書號：SCXK(渝)2007-0001。葡萄糖酸鈉(BR，成都市科龍化工試劑廠，批號：20100909)，氯化鋁六水(AR，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20110113)，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒、肝功測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖酸鋁溶液配制 稱取六水三氯化鋁17.9 mg、葡萄糖酸鈉9.9 mg，溶于雙蒸水，溶液清澈后用0.1 mol/L NaOH將溶液滴定到pH6.0左右，最后用雙蒸水定容為100 ml(Al3+濃度為2%)。

1.2.2 慢性鋁過負荷致肝損傷大鼠模型的建立 24只實驗動物在實驗條件下飼養3 d，分為2組，每組12只大鼠，即空白對照組(等體積的0.3%羧甲基纖維素鈉灌胃給予)，慢性鋁過負荷(200 mg Al3+/kg)模型組。每周灌胃5 d，連續20 w，灌胃容積為1 ml/100 g。動物有關的所有實驗與操作均在重慶醫科大學道德與倫理委員會許可和指導下進行。

1.2.3 組織病理學觀察 在停止給予鋁鹽后第1天，每組各取3只大鼠，用4%水合氯醛 i.p.麻醉后，仰臥固定，打開胸腔，剪碎脾臟作為血液和灌注液出口，由左心室快速滴入肝素化生理鹽水100 ml，然后滴入200 ml多聚甲醛(4%)，進行在體肝組織固定。分離肝組織，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝形態結構變化。

1.2.4 SOD活性和MDA含量測定 停止給予鋁鹽后第2天，每組各取4只大鼠，斷頭處死，收集全血1 ml，肝素抗凝，分離血漿，以進行肝功測定。分離肝組織，用冰冷生理鹽水做成10%勻漿。分別按照SOD和MDA試劑盒說明書要求的操作步驟測定其活性和含量。蛋白質含量采用雙縮脲法，具體操作按雙縮脲蛋白測定試劑盒說明書操作步驟進行。

1.2.5 肝功能測定 將上述血漿進行肝功測定，指標包括血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，門冬氨酸氨基轉移酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，谷氨酰轉肽酶(GGT)，分別按照相應試劑盒說明書要求的操作步驟進行測定。

1.2.6 肝組織鋁離子含量測定 停止給予鋁鹽后第2天，每組各取5只大鼠，斷頭處死，分離肝組織，加入25%四乙基氫氧化銨溶液，80℃消化24 h后加雙蒸水定容，鋁離子含量采用等離子體原子發射光譜分光光度儀(美國，PE)，用內標法測定，測定波長為309.3 nm。

2 結果

2.1 肝組織鋁離子含量 與空白對照組相比，慢性鋁負荷大鼠肝組織鋁離子含量明顯增加〔(1.98±0.19)vs(2.45±0.32)μg/g，P=0.027〕。

2.2 慢性鋁過負荷大鼠肝組織病理形態學變化 空白對照組大鼠肝臟肝小葉結構清楚、完整，肝細胞排列及層次分明，而慢性鋁過負荷模型組大鼠肝臟肝小葉結構雖然仍清楚，但是肝細胞出現明顯空泡變性、顆粒變性和點狀壞死(圖1)。

2.3 慢性鋁過負荷大鼠血漿ALT、AST、ALP和GGT變化 如表1所示，與空白對照組相比，慢性鋁負荷大鼠血漿ALT和AST濃度有增高的趨勢，但是沒有顯著性。而模型組大鼠血漿ALP和GGT水平顯著升高，以ALP升高更為明顯(P＜0.01，P＜0.05)。

表1 鋁負荷大鼠血漿ALT、AST、ALP和GGT變化(s，n=4，IU/L)

與空白對照組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01

ALT AST ALP GGT空白對照組組別34±12.19 85±20.54 91.5±43.09 36±16.8模型組 56±21.88 104.6±32.31 180.4±32.432)65.8±20.31)

表2 慢性鋁過負荷大鼠肝組織SOD活性和MDA含量的影響( s ，n=4)

表2 慢性鋁過負荷大鼠肝組織SOD活性和MDA含量的影響( s ，n=4)

與空白對照組比較：1)P＜0.01

組別 SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)空白對照組11.73±1.56 0.49±0.08模型組 8.19±0.611) 1.37±0.421)

2.4 慢性鋁過負荷大鼠肝組織SOD活性和MDA含量變化與空白對照組相比，慢性鋁過負荷模型組大鼠肝組織SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，(P＜0.01)，見表2。

3 討論

鋁廣泛存在于人們生存的大氣、土壤和水環境，自1827年發現金屬鋁，20年后鋁產品開始出現，以后廣泛應用于工業、農業、交通和生活領域。現有的研究表明鋁不像鐵、錳和鋅等微量元素為機體生理功能所必需，至今尚未發現鋁的生理功能。因此，大多數學者認為鋁進入機體僅造成機體組織器官的損傷。由于鋁主要蓄積在肝的巨噬細胞和溶酶體等細胞器，肝細胞可以將鋁與溶酶體一起從膽汁排泄，因此有學者認為鋁不會導致明顯肝毒性〔5〕。

本研究結果顯示，葡萄糖酸鋁連續灌胃給予20 w，大鼠肝組織鋁明顯增高，同時肝細胞出現明顯空泡變性、顆粒變性和點狀壞死，同時肝功能出現異常改變，ALT和AST濃度有增高的趨勢，而ALP和GGT水平顯著升高。與我們研究結果相似，Bogdanovic等〔8〕采用腹腔注射給鋁(50 mg/kg Al大鼠)，連續7 w，結果發現鋁明顯蓄積，肝基礎結構完整，可見膽管輕度增生和脂肪變性。Viezeliene等〔9〕發現腹腔注射三氯化鋁導致ALT升高4倍，同時GSH明顯下降。大鼠腹腔注射27 mg/kg Al(OH)3，每周3次，連續3 w，明顯誘導了大鼠膽汁郁積和膽小管陰離子轉運障礙，GSH含量明顯降低，MDA含量明顯增加。Türkez等〔10〕采用 34 mg/kg AlCl3灌胃給予大鼠 30 d，血漿ALP、LDH、ALT和AST顯著升高，病理學檢查顯示肝血竇擴張、中央靜脈充血、脂質蓄積和淋巴細胞浸潤。這些結果提示，慢性鋁負荷能明顯導致肝功能異常和肝細胞形態結構損害，應該注意日常生活中鋁的攝入，特別是對于某些長期高濃度接觸鋁的職業工人。

關于鋁組織器官毒性的機制，至今尚不清楚。我們研究結果提示鋁肝毒性的機制可能與鋁促氧化特性有關，但是，是否還有其他機制參與，需要進一步深入研究。

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