針刺放血法對抑郁模型大鼠行為學、海馬齒狀回基質細胞衍生因子-1免疫陽性細胞及其腦源性神經營養因子mRNA表達的影響

羅 強 謝洪武 徐放明 陳日新 (重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 40006)

目前，抑郁癥是醫學研究領域的新熱點，雖然其發病機制尚未清楚，但普遍認為抑郁癥的主要發病誘因是慢性應激，發病過程伴情緒、學習和記憶等認知功能的損害〔1〕。海馬的易受損傷性在各種應激所致疾病中起到至關重要的作用〔2〕。因此，基于齒狀回是海馬認知功能方面的重要區域、海馬苔蘚纖維的軸突出芽在認知功能方面的重要作用〔3〕及基質細胞衍生因子-1(SDF-1)具有軸突的引導和延伸的雙重調節功能〔4〕，而腦源性神經營養因子(BDNF)屬于神經營養因子家族，促進成年海馬齒狀回神經干細胞(NPCs)增殖，維持新生神經元存活，調控海馬神經重塑，參與神經元網絡形成，保護受損神經元〔5〕;我們嘗試聯系抑郁模型大鼠的行為學與海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞及其BDNF mRNA三者來探究針刺放血法治療抑郁癥可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為清潔級SD成年雄性大鼠30只，體重(220±30)g，由重慶醫科大學實驗動物中心提供。合格證號：SCXK(渝)2011-0001。

1.2 方法 將30只大鼠在重慶醫科大學動物房飼養1 w，室溫22～24℃，濕度60%，明暗周期為12/12 h，自由飲水、飲食;期間，訓練大鼠飲用蔗糖水，測定蔗糖水消耗和曠野試驗(OFT)基線值。1 w后選擇評分相近的大鼠，隨機分為3組：正常組10只，模型組10只，實驗組10只。正常組繼續原條件飼養3 w，模型組和實驗組則在單籠孤養和慢性不可預見溫和應激(CUMS)的條件下飼養：①禁食、禁水22 h;②禁水18 h;③傾斜鼠籠45°18 h;④濕籠(150 g木屑加250 ml水)22 h;⑤4℃游泳6 min;⑥持續光照18 h;⑦水平振蕩6 min;⑧行為限制3 h;⑨夾尾1 min。共9種刺激，每天以抓鬮的方法隨機采取1種，共安排3 w時間;其中2 w后，實驗組大鼠隔日予以針刺放血雙側太沖穴(依據《實驗針灸學》動物選穴標準)：針刺工具采用天津華鴻醫材有限公司生產的漢醫牌一次性針灸針，型號為0.25 mm×25 mm;選取雙側太沖穴后用2%的碘酒棉球消毒，再用75%酒精消毒脫碘，單手進針法直刺雙側太沖穴約2～5 mm，每次治療時間10 min，每次行針持續10 s。針刺結束后，于原穴處點刺放血(即古稱“刺血絡”、“刺絡”)，工具采用蘇州環球針灸醫療器械有限公司生產的環球牌小號三棱針，型號為￠1.60×65 mm;操作方法為三棱針點刺法，一次一側放血0.05～0.20 ml，共治療4次。

1.3 大鼠行為學評價 (1)蔗糖水實驗：模型組與實驗組分別在單籠孤養和慢性不可預見溫和應激前、應激后第7、14、21天進行糖水消耗試驗，以檢測大鼠對獎賞的反應性。實驗過程時，大鼠于安靜動物房單籠飼養，10 h禁食禁水后，同時給予1%蔗糖水和純水各一瓶，30 min后調換蔗糖水和純水的位置，60 min后取走兩瓶并稱重。計算動物的糖水消耗比例(糖水消耗比例=糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。(2)OFT：模型組和實驗組分別于單籠孤養和慢性不可預見溫和應激前、應激后第 7、14、21天行 OFT。敞箱裝置由木板制成，底面為60 cm×60 cm的正方形并被等分為16個等邊方格，高50 cm。將大鼠置于中心方格內，觀察其5 min內穿越格數(四爪均進入的方格方既可記數，該項為水平運動得分)和后肢直立次數(兩前爪騰空或攀附木板，為垂直運動得分)，此兩項得分總和為該鼠的OFT評估指標。

1.4 海馬齒狀回免疫組化檢測 先將大鼠升主動脈灌生理鹽水，然后灌注體積分數為4%的多聚甲醛，取腦，上升梯度蔗糖過夜，恒冷箱冰凍切片，片厚為15 μm。免疫組化超敏法，S-P試劑盒購于Neo Markers公司。免疫組化實驗步驟：微波抗原修復，高火6 min。切片滴加過氧化酶阻斷劑，室溫20 min;滴加正常非免疫動物血清，室溫20 min;棄血清，滴加兔抗SDF-1(1∶500)抗體，置于濕盒中，4℃過夜。滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫10 min;滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶溶液，室溫10 min，以上各步驟后都用0.01 mol/L PBS洗3次，每次3 min。DAB顯色3～8 min。常規脫水、透明和中性樹膠封片。替代實驗，以與一抗血清同濃度的正常羊血清代替一抗進行免疫組織化學染色，結果陰性。

1.5 海馬齒狀回實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)實驗 處死動物后，用醫用解剖鏡分離，取出大鼠海馬齒狀回，將組織破碎后，用Triziol法提取總RNA，然后用逆轉錄酶mRNA逆轉錄為cDNA。構建聚合酶體系(上游引物：5'_AAG GGC CAG GTC GATTAGG-3';下 游 引物：5'_GAA CAG GAC GGA AAC AGAACG-3'，Primer Premier5.0 設計)。Taq酶(Promega)催化。熱循環：95℃預熱6 min，40個循環(94℃，20 s;退火20 s;72℃，30 s)。各樣品目的基因和管家基因分別進行SYBR熒光實時定量PCR反應，檢測BDNF受體mRNA表達水平。

1.6 數據分析 ①光學顯微鏡下放大200倍，觀察各組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞在形態學變化。②將全部數據輸入計算機，運用SPSS17.0統計軟件，數據用s表示，所有指標進行正態性檢驗后選擇檢驗方法。糖水消耗比例、OFT評分用單因素方差分析，組間比較用Bonferroni法。

2 結果

2.1 蔗糖水試驗結果 與正常組比，模型組和實驗組大鼠在應激后第7、14天的時間，糖水消耗比例均顯著減少(P＜0.01);但實驗組在應激后第21天的時間，糖水比例較前升高(P＜0.05)，模型組則大致保持原比例(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠應激前后不同時期蔗糖水消耗比例評估( s ，n=10，%)

表1 各組大鼠應激前后不同時期蔗糖水消耗比例評估( s ，n=10，%)

與正常組比較：1)P＜0.01;2)P＜0.05，下表同

組別 應激前 應激第7天 應激第14天 應激第21天正常組75±5 74±5 73±6 73±7模型組 74±6 55±41) 30±81) 32±6實驗組 73±6 54±31) 31±71) 40±32)

2.2 OFT結果 與正常組相比，模型組和實驗組大鼠在應激后第7、14天的時間，水平活動與垂直活動的得分總和顯著降低(P＜0.01);但實驗組應激后第21天的時間，水平活動和垂直活動的得分總和較前增多(P＜0.05)，模型組則大致保持原得分總和(P＞0.05)。見表2。

表2 各組大鼠應激前后不同時期OFT水平和垂直活動得分評估( s ，n=10)

表2 各組大鼠應激前后不同時期OFT水平和垂直活動得分評估( s ，n=10)

組別 應激前 應激第7天 應激第14天 應激第21天正常組60±12 58±15 59±14 56±18模型組 62±10 35±101) 18±131) 20±12實驗組 64±14 32±131) 16±121) 28±132)

2.3 各組大鼠海馬齒狀回BDNF mRNA表達結果 見圖1。與正常組比較，模型組和實驗組的大鼠海馬齒狀回BDNF mRNA表達均下降(P＜0.05)，尤以模型組顯著(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠海馬齒狀回BDNF mRNA表達比較圖

2.4 大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的形態分布結果①正常組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的胞體呈圓形或橢圓形并且有一個至多個突起，胞核較大，胞漿呈黃色或棕黃色，數量較少，免疫陽性細胞沿齒狀回顆粒細胞層規律性地分布，具有向同一方向聚集的趨勢。②模型組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的胞體呈圓形或橢圓形空泡狀，胞核小，胞漿呈淺黃色，數量多，免疫陽性細胞沿齒狀回顆粒細胞層無規則地分布，無固定的聚集趨勢。③實驗組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的胞體呈圓形或橢圓形并且有一個至多個突起，胞核適中，胞漿呈黃色，數量適中，免疫陽性細胞沿齒狀回顆粒細胞層無規則地分布，具有一定的聚集趨勢。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞形態分布(DAB，×200)

3 討論

抑郁癥即中醫郁證，其病因病機文獻早有記載。肝氣郁結，氣機失調是本病之根〔6，7〕;疏通調理肝脈是關鍵〔8〕。本實驗獨取太沖為治療穴，因該穴系肝經原穴，是人體生命活動的原動力，為十二經脈維持正常生理功能之根本〔9〕。正如《靈樞·九針十二原》：“五臟有疾也，應出十二原，十二原各有所出，明知其原，睹其應而知五臟之害矣。”可見，原穴往往調控著該經的總體氣血。實驗中模擬應激因子的多變性和不可預見性而成功造抑郁模型大鼠，本質上較為真實地反映抑郁癥病人的某些癥狀和病因。實驗過程中，抑郁模型大鼠的行為學評分相對正常組明顯下降，但實驗組經針刺放血治療后，其行為學評分較前明顯升高，由此證實針刺放血法在治療抑郁癥方面的確切療效。

本實驗結合大鼠海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞及其BDNF mRNA表達情況進行抑郁癥生理病理基礎和抗抑郁治療方面的研究，整個實驗的結果支持抑郁癥的“神經營養學說”，即抑郁癥的發生主要與神經突出可塑性的損害相關〔10〕，一定程度上解釋抑郁癥的延遲效應〔11〕;而針刺放血法等抗抑郁治療則可通過增強海馬齒狀回SDF-1免疫陽性細胞的表達，促使其海馬苔蘚纖維軸突的出芽，調控大鼠BDNF激活腦內氧化抗氧化系統等信號轉導通路從而達到治療抑郁癥的目的。目前，針灸治療抑郁癥，更多的研究其可提高腦內5-HT的水平〔12〕，增強中樞NE、5-HT的代謝，協調它們之間的關系，調整海馬腦源性神經營養因子的表達，保護海馬細胞神經元〔13〕。總之，針灸治療抑郁癥是多方向，多靶點的綜合效應，不僅可以緩解抑郁情緒，還可以通過整體調節作用改善飲食、睡眠等多系統癥狀，與西藥同用還可減輕藥物副作用。因此針灸治療抑郁癥必將受到越來越多的關注與研究，為其臨床療效提供更多的理論依據。

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