絲膠對糖尿病大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)細胞神經(jīng)肽Y表達的作用

李 強 李山山 張 艷 鐘美蓉 陳志宏 (承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，河北 承德 067000)

神經(jīng)肽Y(NPY)是從豬腦中提取的含36個氨基酸的多肽，屬胰多肽家族成員。它廣泛分布于哺乳動物的器官和組織，參與調(diào)節(jié)機體的多項生理功能〔1〕;同時有研究發(fā)現(xiàn)許多疾病時伴有NPY的改變〔2〕。NPY與糖尿病多種并發(fā)癥有關(guān)，如糖尿病自主神經(jīng)病變、血管病變、腎臟病變及糖尿病視網(wǎng)膜病變等。本研究通過觀察2型糖尿病大鼠脊髓及脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY表達的變化探討NPY在糖尿病周圍神經(jīng)損傷時的作用機制;同時觀察絲膠(蠶繭水提物)對NPY表達變化的作用，以期為治療糖尿病周圍神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司;兔抗NPY一抗，武漢博士德公司。絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，彩色蠶繭由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。

1.2 實驗動物的選擇及分組 3月齡清潔級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量200～250 g(合格證號：712024)，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機選取其中的12只作為正常對照組，常規(guī)飼養(yǎng)，不做任何處理;其余的24只小劑量STZ連續(xù)腹腔注射(2%STZ，25 mg/kg，3 d)建立2型糖尿病模型，7 d后以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標(biāo)準(zhǔn)〔3〕;然后再隨機分為糖尿病模型組和絲膠治療組，模型組大鼠不再給予任何處理，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg－1·d－1)灌胃 35 d。

1.3 檢測血糖 各組大鼠用藥結(jié)束后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血，3 000 r/min離心20 min后取血清，應(yīng)用全自動臨床生化分析儀檢測血糖。

1.4 脊髓前角細胞和脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白表達的檢測及定量分析 大鼠斷頭處死，取坐骨神經(jīng)對應(yīng)的脊髓節(jié)段(L4-6)和脊神經(jīng)節(jié)，Bouins液固定后石蠟包埋、切片，片厚5 μm。采用免疫組化SP法觀察NPY蛋白的表達。一抗?jié)舛?∶50，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照;以神經(jīng)細胞胞核和(或)胞漿出現(xiàn)棕褐色顆粒為免疫陽性反應(yīng)。在顯微鏡下(10×20)采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進行定量分析，計算免疫陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值，作為NPY蛋白表達的相對水平。每張切片隨機選取3個視野，每只大鼠選取6張切片，每組隨機選取6只大鼠，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖的變化及絲膠的作用 與正常對照組比較，模型組大鼠的血糖明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，絲膠治療組大鼠的血糖明顯降低(P＜0.01)。見表1。

2.2 各組大鼠NPY蛋白的表達及絲膠的作用 NPY蛋白免疫陽性產(chǎn)物為棕褐色顆粒狀，位于脊髓前角細胞和脊神經(jīng)節(jié)細胞的胞漿和胞核，以胞漿為主(圖1，圖2)。與正常對照組比較，模型組大鼠脊髓前角細胞和脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白表達明顯升高(P＜0.01);與模型組大鼠比較，絲膠治療組大鼠脊髓前角細胞和脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白表達明顯降低(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠的血糖和脊髓前角細胞、脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白的表達( s ，n=12)

表1 各組大鼠的血糖和脊髓前角細胞、脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白的表達( s ，n=12)

與模型組比較：1)P＜0.01

脊神經(jīng)節(jié)細胞正常對照組 10.83±2.031) 0.074±0.0221) 0.178±0.0451)組別 血糖(mmol/L)NPY蛋白表達脊髓前角細胞模型組 29.45±4.82 0.139±0.022 0.511±0.033絲膠治療組 13.20±4.091)0.067±0.0331)0.313±0.0461)

圖1 各組大鼠脊髓前角細胞NPY蛋白的表達(DAB，×200)

圖2 各組大鼠脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白的表達(DAB，×200)

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥和主要致殘原因。病程超過20年的糖尿病患者，周圍神經(jīng)病變的發(fā)生率約為60%，且隨病程延長逐漸增加〔4，5〕。糖尿病周圍神經(jīng)病變以臟腑陰虛燥熱、氣陰兩虛、津液疏布失常為基礎(chǔ)，日久導(dǎo)致癖血阻滯經(jīng)絡(luò)，出現(xiàn)肢體疼痛、麻木等表現(xiàn)。目前，治療糖尿病周圍神經(jīng)病變大多以控制血糖為主，同時輔以營養(yǎng)神經(jīng)及活血化瘀的藥物，但控制血糖西藥的毒副作用不容忽視。蠶繭為蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消〔6，7〕。民間有蠶繭泡水降血糖的驗方，本課題組的前期研究亦發(fā)現(xiàn)，絲膠具有效降低血糖、保護糖尿病腎臟損傷等作用〔8〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠脊神經(jīng)節(jié)細胞和脊髓前角細胞NPY的表達明顯高于正常大鼠。NPY可抑制胰島β細胞分泌胰島素，β細胞分泌的胰島素反過來也可抑制NPY的合成和分泌〔9〕;糖尿病時胰島β細胞分泌的胰島素減少，對NPY的反饋抑制作用減弱，致使NPY合成和分泌增多〔10〕。NPY的表達上調(diào)，可通過抑制神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)及縮血管效應(yīng)使神經(jīng)組織缺血、缺氧，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能受損。

絲膠為彩色蠶繭經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成，是蠶繭中溶于水的具有多種生物活性的蛋白質(zhì)，其中的氨基酸以絲氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等為主。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠治療組大鼠脊神經(jīng)節(jié)細胞和脊髓前角細胞NPY的表達明顯低于糖尿病模型組大鼠，說明絲膠可通過降低NPY蛋白的表達，減弱NPY抑制神經(jīng)元分泌神經(jīng)遞質(zhì)的作用及NPY的縮血管效應(yīng)，緩解神經(jīng)組織的缺血、缺氧，進而恢復(fù)受損神經(jīng)的生理功能。

綜上所述，絲膠可通過下調(diào)糖尿病大鼠脊髓前角細胞和脊神經(jīng)節(jié)細胞NPY蛋白的表達，發(fā)揮對坐骨神經(jīng)相關(guān)神經(jīng)元胞體的保護作用，本研究可為臨床治療糖尿病周圍神經(jīng)病變提供新思路。

1 Jacques D，Sader S，Perreault C，et al.NPY and NPY receptors：presence，distribution and roles in the regulation of the endocardial endothelium and cardiac function〔J〕.EXS，2006;95(1)：77-87.

2 彭彥霄，賈雪梅.神經(jīng)肽Y研究進展〔J〕.四川解剖學(xué)雜志，2003;11(4)：42-4.

3 Xiang X，Wang Z，Zhu Y，et al.Dosage of streptozocin in inducing rat model of type 2 diabetes mellitus〔J〕.Wei Sheng Yan Jiu，2010;39(2)：138-42.

4 Harati Y.Diabetic peripheral neuropathies〔J〕.Ann Intern Med，1987;107(4)：546-59.

5 Lepore G，Maglio ML，Cuni C，et al.Poor glucose control in the year before admission as a powerful predictor of amputation in hospitalized patients with diabetic foot ulceration〔J〕.Diabetes Care，2006;29(8)：1985-92.

6 李時珍.本草綱目〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：1045-52.

7 鮑相敖.驗方新編〔M〕.天津：天津科技出版社，1993：736-40.

8 宋成軍，郝祥俊，陳志宏.絲膠對糖尿病腎病大鼠腎功能和腎臟TIMP-1表達的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2011;30(15)：2157-9.

9 Sindelar DK，Mystkowski P，Marsh DJ，et al.Attenuation of diabetic hyperphagia in neuropeptide Y-deficient mice〔J〕.Diabetes，2002;51(3)：778-83.

10 Imai Y，Patel HR，Hawkins EJ，et al.Insulin secretion is increased in pancreatic islets of neuropeptide Y-deficient mice〔J〕.Endocrinology，2007;148(12)：5716-23.