鐮形棘豆總黃酮對TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞增殖的研究*

王曉紅，楊曉云，李 欽，楊麗霞，李曉東，姜 華

(1．嘉峪關市第一人民醫院，甘肅 嘉峪關735100; 2．甘肅省中醫學校，甘肅 蘭州730050;3．甘肅省中醫藥研究院，甘肅 蘭州730050)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最為常見的慢性微血管并發癥之一，嚴重威脅著糖尿病患者的生命。在美、日和歐洲等發達國家和地區，DN 已成為終末期腎臟疾病的首位病因(約占35%)和糖尿病患者死亡的主要原因，在我國DN 發病率也呈逐年上升趨勢［1］。目前，DN 的發病機制尚未明確。既往認為DN 的早期病變部位在腎小球，近年來研究發現腎小管病變及腎間質纖維化的程度與腎功能的相關性更為密切，故腎間質纖維化的機制在DN 的發展中越來越受到人們的重視［1］。細胞增殖是組織器官發生纖維化的病理改變之一，一般發生在纖維化形成初期，因此，為了早期預防纖維化的發展，抑制細胞增殖顯得至關重要。鐮形棘豆總黃酮是甘肅省中醫藥研究院中藥研究所提取分離的鐮形棘豆的有效組分。前期研究［2－3］表明:鐮形棘豆藥材氯仿提取物、總黃酮苷元及主要黃酮化合物具有較強的抑菌、抗炎、抗氧化的作用。目前大量研究表明:植物黃酮類化合物在治療糖尿病及其并發癥方面具有顯著療效［4－6］，蕎麥花葉總黃酮、玉米須總黃酮、葛根黃酮等黃酮苷藥物具有降血糖、改善胰島素抵抗的的功效，有些已應用于臨床［7－9］。為了進一步探討鐮形棘豆總黃酮的藥理作用，本課題研究了鐮形棘豆總黃酮干預轉化生長因子－β1(TGF-β1)誘導人腎小管上皮細(HK-2)胞增殖情況，為其防治DN 腎纖維化的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 動 物

SPF 級Wistar 大鼠24 只，雄性，體質量(200 ±20)g，購于甘肅中醫學院動物中心，許可證號:SCXK(甘)2004-0006。普通飼料喂養，飼養于蘭州軍區總醫院屏障級動物實驗室，許可證號:SYXK-(軍)2007-022。

1．2 細胞株

HK-2 購自蘭州大學實驗中心。

1．3 藥品、試劑與儀器

鐮形棘豆總黃酮，由甘肅省中醫藥研究院中藥研究所提供。DMEM/F12(1∶1)細胞培養基，購自Gibco 公司;胎牛血清，購自Hyclon 公司;MTT、EDTA、胰蛋白酶、DMSO，均購自Amresco 公司;人重組TGF-β1，R＆D System，產地美國，根據說明書，用含1 g /L 牛血清白蛋白的無菌弱HCl(4 mM)配制為1 ng/L 的儲存液，無菌EP 管－70 ℃儲存，用時配成10 pg/L 濃度［10］。HEAL CELL HL90 二氧化碳培養箱，香港力康生物醫療科技控股有限公司產品;BSC－1000IIA2 生物潔凈安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司產品;Olympus X－71 倒置顯微鏡，產地日本;CliniBio 128L－400 酶標儀，產地奧地利。

1．4 鐮形棘豆總黃酮藥物血清制備

將24 只大隨機分為空白組、藥物組(鐮形棘豆總黃酮)2 組，每組12 只。適應性喂養1 周后，藥物組按300 μg/g 給大鼠灌胃，空白組灌服同體積生理鹽水，每次10 μL/g 體質量，2 次/d，連續灌胃3 d。于末次灌胃前8 h 禁食不禁水;末次灌胃30 min 后，大鼠股動脈無菌采血;靜置2 h，3000 r/min 冷凍離心20 min，取上清;將同組血清混合，56 ℃水浴滅活30 min，－20 ℃低溫保存備用。

1．5 細胞培養與實驗分組

HK-2 細胞用含體積分數10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈 霉素DMEM/F12(1∶1)完全培養基，于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養。每隔2～3 d 換新鮮培養基1 次，培養融合至80 % 以上，用含2．5 g/L 胰蛋白酶、0．5 g/L EDTA 的消化液消化，用完全培養基終止消化后，1000 r/min 離心5 min。用新鮮培養基將細胞重懸后進行傳代培養。實驗前先用無血清培養基培養24 h 使細胞同步化，實驗重復3 次。傳代培養的HK-2 細胞分為以下4 組:①空白對照組:DMEM/F12 培養液。②單純TGF-β 誘導組:DMEM/F12 培養液+ 10 μg/L TGF-β1。③空白血清對照組:DMEM/F12 培養液+10 μg/L TGF-β1+ 體積分數10%空白血清。④干預組:DMEM/F12 培養液+10 μg/L TGF-β1+體積分數10%鐮形棘豆總黃酮藥物血清。

1．6 檢測指標

1．6．1 細胞形態觀察

細胞以1．5 ×105個/mL 密度接種于6 孔板，每孔2 mL，每組2 個復孔。在37 ℃、體積分數5%CO2孵箱培養過夜。吸棄細胞上清，加入無血清培養基2 mL 靜止24 h，使其同步化。棄細胞上清，按分組加入相應藥品2 mL，對照組加入培養基2 mL。孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照。

1．6．2 MTT 法檢測細胞增殖

細胞以3 ×104個/mL 密度接種于96 孔板，每孔100 μL，每組5 個復孔。在37 ℃、體積分數5%CO2孵箱培養過夜。吸棄細胞上清，加入無血清培養基100 μL 靜止24 h，使其同步化。棄細胞上清，按分組加入相應藥品100 μL，對照組加入培養基100 μL，分別在24，48，72 h 時各取出1 板，棄培養上清液，加入1 g/L MTT 100 μL 孵育4 h。棄上清，加入DMSO 100 μL，左上角孔中加入100 μL DMSO作為“調0 孔”，振蕩10 min 使藍紫色結晶完全溶解，在酶標儀上492 nm 處測定吸光A 值。

1．7 統計學方法

采用SPSS 13．0 統計分析軟件處理。數據以均數()±標準差(s)表示，進行單因素方差分析(Oneway ANOVA)。以P＜0．05 為差別有統計學意義。

2 結 果

2．1 鐮形棘豆總黃酮對HK-2 細胞形態的影響

倒置顯微鏡下觀察顯示:正常狀態下，HK-2 呈鋪路石樣貼壁生長。經10 μg/L TGF-β1誘導后，細胞變長呈梭形，細胞間隙變大，細胞整體呈現纖維樣生長，但與鐮形棘豆總黃酮藥物血清共同干預后，細胞的纖維樣狀態變化不明顯，而空白血清無此作用。見圖1。

圖1 鐮形棘豆總黃酮對HK-2 細胞形態的影響

2．2 鐮形棘豆總黃酮對HK-2 細胞增殖的影響

MTT 法檢測結果顯示:HK-2 細胞經TGF-β1誘導后增殖明顯，與空白對照組對比，差別有統計學意義(P＜0．05)，且細胞增殖具有顯著的時間依賴性;但經過與鐮形棘豆總黃酮藥物血清共同干預，細胞增殖在一定程度上受到抑制，與單純TGF-β1誘導組對比，差別有統計學意義(P＜0．05)，而空白血清無此作用。見表1。

表1 不同時間點各組HK-2 細胞增殖情況對比吸光值A492 nm，n=6，±s

表1 不同時間點各組HK-2 細胞增殖情況對比吸光值A492 nm，n=6，±s

注:與空白對照組對比，* P ＜0．05;與單純TGF-β1 誘導組對比，# P ＜0．05。

A 24h A 48h A 72h空白對照組 0．247±0．004# 0．291±0．004# 0．311±0．003組 別#單純TGF-β1 誘導組 0．287±0．005* 0．343±0．009* 0．362±0．006*空白血清對照組 0．287±0．005* 0．346±0．008* 0．358±0．005*干預組 0．263±0．004# 0．315±0．003# 0．332±0．015#

3 討 論

DN 時腎小管病變可發生在腎小球病變之前、之后或同時發生。病變初期表現為腎小管基底膜增厚、小管數目增加及小管肥大，后期發生腎小管萎縮及間質纖維化。腎間質纖維化是所有慢性腎臟疾病進行性發展的重要病理基礎［11］。多年研究證明:TGF-β 超表達是腎纖維化形成的關鍵因子。TGF-β超表達能促進細胞增殖，而細胞增殖是組織器官發生纖維化的病理改變之一，一般發生在纖維化形成初期，是細胞外基質(ECM)產生的主要來源，而ECM 過度沉積是纖維化病變的主要特征［12］。目前，許多研究已將TGF-β 作為研究腎小管上皮細胞向成纖維細胞轉分化的經典誘導因子。

現代醫學針對腎間質纖維化的防治措施主要有使用血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑、TGF-β1中和抗體或天然拮抗劑、基因治療等諸多方面，但其抗腎纖維化效果并不理想。近年來，中醫藥從扶正固本、活血化瘀、清熱利濕、化濁排毒等多個角度，從單味中藥、中藥有效成分及中藥復方制劑多個方面進行抗纖維化的實驗及臨床研究，取得了一定的進展［13－14］。

本實驗研究發現:鐮形棘豆總黃酮在一定程度上具有抑制TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞增殖的作用。顯微鏡下觀察顯示:鐮形棘豆總黃酮能預防TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞的纖維樣改變，在一定程度上維持了細胞形態的穩定性。MTT 檢測顯示:鐮形棘豆總黃酮能夠抑制TGF-β1誘導人腎小管上皮細胞增殖，在一定程度上預防了早期纖維化的形成。

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