胱抑素C在巴斯德畢赤酵母的高效分泌表達及免疫原性分析

王清，葛瑩，宋廣輝，趙素芝

（1 青島大學醫學院附屬醫院檢驗科，山東 青島 266100； 2 山東省煤炭泰山療養院內二科）

血清胱抑素C（Cys C）作為一種新的反映腎小球濾過率（GFR）的內源性標志物，為判斷腫瘤、肝硬化、腎衰竭等疾病中GFR的變化提供了快速、精確而又簡單的方法。有人已經原核表達了Cys C，由于融合蛋白以包涵體形式存在，包涵體蛋白的復性和純化過程非常復雜，而且由于原核生物密碼子的偏性，導致了真核基因在原核表達系統表達率較低［1］。畢赤酵母表達系統作為一種適宜表達外源基因的真核表達系統，得到了廣泛的應用［2］。本研究利用該表達系統，使Cys C基因在巴斯德畢赤酵母（P.pastoris）中表達，并對表達產物進行了免疫原性分析。現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 P.pastoris GS115（His－，Mut＋）和質粒p PIC9k由本室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內切酶（Takara生物技術有限公司），蛋白分子質量標準（上海拜力生物科技有限公司），G418、生物素、酵母氮源（YNB）和硝酸纖維素膜（上海生工生物工程有限公司），顆粒增強透射免疫比濁法（PETIA）CysC檢測試劑盒（北京利德曼生物技術有限公司），Bio－Rad Gene Pulser電轉化儀、CysC蛋白標準品（新城生物科技股份有限公司），鼠抗人CysC單克隆抗體（Abcam公司，英國）。

1.1.3 培養液 YEPD：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，p H 6.0，115℃濕熱滅菌20 min。MD：13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，20 g／L葡萄糖，15 g／L瓊脂。BMGY：2 g／L蛋白胨，1 g／L酵母提取物，100 mmol／L磷酸鉀緩沖液（p H 6.0），13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，1 g／L甘油。BMMY：將 BMGY 中的1 g／L甘油替換為5 g／L甲醇。MM：13.4 g／L YNB，4×10－4g／L生物素，5 g／L甲醇。

1.2 方法

1.2.1 構建攜帶合成Cys C基因的重組表達載體p PIC9k－Cys C 根據 Cys C的 mRNA 序列（Gen－Bank公布）進行分析，按照P.pastoris GS115（His－，Mut＋）表達系統密碼子偏好［3］，優化基因序列，檢查基因內部有無特別復雜二級結構和重復序列；用P.pastoris GS115（His－，Mut＋）偏愛的密碼子替代野生型Cys C基因序列中的酵母稀有密碼子，調整GC含量，消除富含AT的序列區段，避免翻譯的提前終止，并且避免可能影響mRNA穩定性的連續5個或5個以上的A／T或G／C重復序列。合成Cys C基因經同義密碼子修改以后，所編碼蛋白質的氨基酸序列并未發生變化。根據基因序列的分析結果，人工合成Cys C，連接至目的載體p PIC9k，構建p PIC9k－Cys C并轉化到感受態細胞DH5中，測序，驗證重組克隆中基因序列是否與要求相符。

1.2.2 轉化P.pastoris GS115 將5～20μg質粒DNA用SalⅠ線性化，電轉化GS115細胞（參數：電壓1.5 k V，電容25μF，電阻200Ω），電擊時間4～10 ms，His＋轉化子接種到無組氨酸的MD平板上，30℃培養3～4 d。然后，PCR分析目的基因是否整合到基因組中。設計一對用于擴增插入片段的引 物，引物序列如下：5′AOX1－F，5′－GACTGGTTCCAATTGACAAGC－3′；3′AOX1－R，5′－GCAAATGGCATTCTGACATCC－3′。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，25個循環；72℃延伸10 min。

1.2.3 重組酵母陽性轉化子的多拷貝整合篩選根據p PIC9k中的表達手冊（Invitr ogen公司）篩選多拷貝整合菌株。將轉化菌落分別點在G418濃度分別為0.5、1.0、2.0、3.0 g／L的 YEPD培養板上，30℃培養3～4 d，篩選多拷貝整合菌株。然后將高拷貝的重組子分別對應點于MM和MD培養板上，篩選His＋Mut＋陽性克隆。

1.2.4 Cys C的誘導表達 將G418篩選出的高拷貝轉化子3株分別接種于100 mL BMGY增菌培養液中，28～30℃、280 r／min振蕩過夜至A600為3～6。3 000 r／min離心5 min收集細胞，在4℃下將細胞沉淀物重新懸浮在500 mL含10 g／L酪氨酸BMMY（p H 6.0）培養液中，使懸浮液A600＝1。每24 h加10 g／L甲醇，誘導表達5 d，收獲的時間間隔為0、24、48、72、96和120 h，用 PETIA Cys C檢測試劑盒確定最佳收獲時間。空載體p PIC9k轉化子作為陰性對照，在相同條件下被誘導。

1.2.5 SDS－PAGE和 Wester n blot分析 取30 μL培養物上清液在120 g／L SDS－PAGE上電泳，考馬斯亮藍R－250染色。通過SDS－PAGE分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，然后用鼠抗人Cys C單克隆抗體（1∶1 000稀釋）孵育，并用小鼠抗兔Ig G（1∶4 000稀釋）與辣根過氧化物酶（HRP）耦聯。洗膜，用四甲基聯苯胺（T MB）反應10 min。

1.2.6 動物免疫及血清抗體檢測 將Bal b／c小鼠隨機分為A組和PBS組，每組12只。A組每只小鼠皮下注射50μg純化的酵母表達重組蛋白和等體積完全弗氏佐劑，PBS組注射PBS和等體積完全弗氏佐劑。首次免疫后14 d加強免疫1次，7 d后再免疫1次，追加免疫用不完全弗氏佐劑，共免疫3次。眶靜脈取血，4℃放置分離血清，－20℃凍存備用。應用標準品Cys C蛋白作為抗原間接ELISA檢測免疫小鼠血清中抗Ig G抗體。

1.2.7 Cys C定量測定 用PETIA Cys C檢測試劑盒確定最佳收獲時間。取各個時間間隔少量培養液，離心后用日立全自動生化分析儀PETIA Cys C試劑盒測定Cys C濃度，嚴格按說明書操作。

2 結 果

2.1 優化后的Cys C基因

120個氨基酸密碼子中有77個進行了優化，消除避免可能影響mRNA穩定性的連續5個或5個以上的A／T或G／C重復序列9處，中止子由TAG轉換為TAA。優化基因序列后GC含量由原來的60.8%降低到37.7%。合成的基因使用同義的密碼子而氨基酸序列沒有變化。所設計的合成Cys C基因與野生型Cys C基因序列對比見表1。

表1 合成CysC基因與野生型CysC基因序列對比

2.2 重組質粒p PIC9k－Cys C的鑒定

以少量堿裂解法快速提取的重組質粒p PIC9k－Cys C，經Eco RⅠ及NotⅠ雙酶切及DNA序列分析顯示，重組質粒p PIC9k－Cys C符合設計要求，重組克隆構建成功。

2.3 重組質粒對酵母菌的轉化及轉化子的鑒定

電轉化法轉化畢赤酵母，能產生足夠數量的轉化體。

2.4 SDS－PAGE分析

陽性表達菌在相對分子質量約19 000處有一條帶，空載體陰性對照菌未見該條帶。表達水平與拷貝數呈正比，即高拷貝高表達，產物約占分泌總蛋白的80%以上（圖1）。

圖1 表達產物的SDS－PAGE分析

2.5 Wester n blot測定

通過SDS－PAGE分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，能與相應Cys C抗體形成單一蛋白條帶，證明表達純化的蛋白是Cys C蛋白（圖2）。

2.6 Cys C抗血清效價和特異性鑒定

ELISA間接法測定抗血清效價為1∶8 000；Wester n blot測定顯示抗血清能與Cys C標準品發生免疫反應。

2.7 Cys C定量測定

Cys C定量測定結果顯示，Cys C高拷貝轉化子誘導表達的最佳收獲時間為120 h，其上清液濃度達到600～950 mg／L。

圖2 CysC表達蛋白鑒定

3 討 論

Cys C是一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，在抗病毒、抑制腫瘤的生長、預防食品加工過程中蛋白水解方面具有潛在的應用價值。此外，內源性Cys C是一種檢測GFR的新指標。雖然已在大腸埃希菌中表達了Cys C融合蛋白，但該蛋白多以包涵體形式存在，而且由于原核生物密碼子的偏性，導致了大腸埃希菌為宿主菌的原核表達產物量低［1－4］。

為了高純度、高產量表達Cys C蛋白，本研究選擇了p PIC9k作為表達載體，并在P.pastoris GS115中表達Cys C。因為許多外源蛋白質在酵母中表達，得到類似于在哺乳動物細胞中產生的、結構和生物活性相似的天然的蛋白質［5－6］。此外，p PIC9k中的α因子分泌信號序列，使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達系統。p PIC9k為整合型分泌表達載體，畢赤酵母His＋轉化子高拷貝整合事件自發發生的概率為1%～10%，p PIC9k含有細菌kan基因，賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kan基因的數目。單拷貝p PIC9k整合入畢赤酵母基因組后，賦予P.pastoris約0.25 g／L的遺傳霉素抗性水平。任何載體多拷貝整合可增加遺傳霉素抗性水平，從0.5 g／L（1～2拷貝）到4.0 g／L（7～12拷貝）。由于kan基因與表達盒（p AOX1及目的基因）之間有遺傳連鎖，可從遺傳霉素高抗性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數［7］。由于基因的劑量效益，蛋白的表達可能會增加，拷貝數越高表達量也越高［8］。

外源蛋白可在P.pastoris胞內表達或分泌至胞外。分泌表達需要蛋白上的信號肽序列，將外源蛋白靶向分泌至胞外。P.pastoris只分泌很少的自身蛋白，加上P.pastoris最小生長培養基中只有少量的蛋白，這意味著分泌的外源蛋白是培養基中蛋白的主要組成成分，也可算作蛋白純化的第一步。

在P.pastoris中表達較高的基因往往是采用P.pastoris本身所偏愛的密碼子，研究也表明在所有61個密碼子中有25個是P.pastoris偏愛的。趙翔等［9］通過對P.pastoris的28個蛋白編碼同義密碼子的使用情況進行分析，確定了P.pastoris的19個高表達優先密碼子。多位學者通過對密碼子進行優化，改良基因，大大提高了異源基因在P.pastoris中的表達［10－12］。

在以往的研究中，P.pastoris表達的Cys C基因均使用野生型基因［13］，其密碼子可能不是宿主細胞進行高水平表達所偏愛的密碼子，因此表達水平應有提升空間。本研究根據P.pastoris表達系統的特性，在氨基酸序列不變的條件下，重新設計Cys C基因，去除復雜的二級結構和重復序列，調整GC含量，消除富含AT的序列區段，避免翻譯的提前終止，并且避免可能影響mRNA穩定性的連續5個或5個以上的A／T或G／C重復序列。在120個氨基酸密碼子中有77個進行了優化，消除避免可能影響mRNA穩定性的連續5個或5個以上的A／T或G／C重復序列9處，終止子由TAG轉換為TAA。優化基因序列后，GC含量由原來的68.6%降低到43.6%。通過密碼子優化，Cys C的表達水平達到600～950 mg／L的標準，雖然其數值略低于通常高5～10倍的密碼子優化的研究結果［14］，但它仍然高于其他研究結果［15］。

本研究用P.pastoris表達重組Cys C的優點為：①在酵母真核表達系統中進行重組表達，表達產物無需包涵體的變性和復性處理，也不需融合蛋白的凝血酶切割，誘導表達后收集培養液上清即可得到活性的Cys C；②表達量高，雜蛋白很少，表達量可以達到克級，即使不純化，蛋白純度也可達到80%以上；③根據酵母密碼子偏好，優化Cys C序列，可以進一步提高Cys C表達量。可見，根據P.pastoris密碼子的偏好，將人Cys C基因進行密碼子優化和表達，為外源基因的表達提供了一種理想的方法。

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