丹參注射液對腦梗死患者自體外周血干細胞旁分泌BDNF的影響1）

趙 寧，楊萬章，李 嬌，戴 映，楊志剛

正常情況下，外周血中的造血干細胞（PBHSC）數量很少，重組粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）已經廣泛用于PBHSC動員治療缺血性心腦血管疾病［1］，rhG-CSF本身也可通過抗氧化、抗炎等作用促進神經修復［2］。丹參具有誘導骨髓間充質干細胞轉化為神經元樣細胞的作用［3］。本研究旨在觀察丹參注射液及rhG-CSF治療前后腦梗死患者外周血BDNF表達的變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年5月—2012年2月我院住院治療的年齡40歲～75歲腦梗死恢復期患者60例，符合《各類腦血管疾病診斷要點》和《中風病診斷與療效評定標準》（試行）診斷標準，平均發病時間15d～64d。按照納入時間先后隨機分為4組，各15例。丹參＋rhG-CSF組15例，男9例，女6例，年齡（51.66±9.43）歲；rhG-CSF組15例，男8例，女7例，年齡（50.60±8.57）歲；丹參組15例，男10例，女5例，年齡（55.0±11.23）歲；常規組15例，男12例，女3例，年齡（55.26±11.68）歲。4組患者性別、年齡、病程、危險因素差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。排除短暫性腦缺血發作、腦出血（經CT診斷）、出血性腦梗死及蛛網膜下腔出血、腦外傷、腦腫瘤、腦寄生蟲、代謝障礙引起的偏癱、風濕性心臟病、冠心病及其他合并房顫所引起的腦栓塞者等。

1.2 方法

1.2.1 試驗藥物 重組人粒細胞集落刺激因子（商品名：吉粒芬，杭州九源基因工程有限公司，批號：011705）；丹參注射液含生藥1.5g／mL（杭州正大青春寶藥業有限公司，批號：02011102）。

1.2.2 試驗方法 常規組：常規治療予康復訓練，包括偏癱肢體綜合訓練、關節松動、運動療法、手功能訓練、言語構音訓練、神經肌肉電刺激、日常生活能力訓練及針灸等，每天1次，3周為一個療程。抗血小板聚集藥、降壓藥、降糖藥、降脂藥等。丹參組：丹參注射液20mL／d靜脈輸注，連用7d，余治療同常規組。rhG-CSF組：在抽血檢查次日08：00皮下注射吉粒芬300 μg，連用3d，余治療同常規組。丹參＋rhG-CSF組：第1天開始連續使用丹參注射液20mL／d靜脈輸注7d，同時在丹參注射液滴注第2天08：00皮下注射rhG-CSF 300μg，連用3d，余治療同常規組。4組均以7d為1個療程。

1.2.3 指標檢測 4組均在療程1d～7d次日晨采外周靜脈血標本檢測，并做臨床評定。采用雙抗體夾心酶聯免疫（ELISA）法。樣品稀釋：以50μL待測血清樣品＋250μL樣品稀釋液將待測樣品稀釋5倍。實驗過程：加入30μL血清到含120μL酸-乙醇提取液的EP管中；振蕩并在室溫下搖晃孵育30min；以10 000r／min離心5min，再轉移100μL上清液到含200μL三羥甲基氨基甲烷緩沖液 （pH=7.6）的EP管中，充分混勻。加入300μL試驗稀釋液A，充分混勻，立即檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0軟件處理。計量資料以均數±標準差（x±s）表示。滿足正態性和方差齊性時，各組治療前后比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。

2 結 果

丹參＋rhG-CSF組、rhG-CSF組治療前后BDNF比較差異有統計學意義（P＜0.05）；與常規組治療后比較，丹參＋rhGCSF組、rhG-CSF組BDNF差異有統計學意義（P＜0.05）；丹參＋rhG-CSF組與丹參組、常規組治療前后差值比較差異有統計學意義（P＜0.05）；rhG-CSF組與丹參組、常規組治療前后差值比較差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 4組治療前后血清BDNF的變化（x±s） ng／mL

3 討 論

BDNF是一種中樞神經系統內合成的神經營養因子，對神經元的存活、分化及生長有著重要的作用［4］。BDNF在中樞神經元中可能通過TrkB受體介導細胞外信號調節激酶 （extracellular signal-related kinases，ERKS）and Beta-連環蛋白（B-catenin）磷酸化來促進神經元的成熟及重塑，促進軸突再生［5］。Keng等［6］發現在坐骨神經損傷大鼠中，移植BDNF轉染的神經干細胞能明顯促進髓鞘形成、組織再生以及血管的發生，促進功能修復。Haiying等［7］運用BDNF基因修飾過的神經干細胞治療創傷性顱腦損傷大鼠，發現修飾后的干細胞能過度表達BDNFmRNA，移植后細胞存活的數量和比例、突觸前及突觸后蛋白的表達及神經元標識物Tubulin表達，明顯高于未經修飾的干細胞治療組，同時干細胞本身還分泌幾種營養因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）及胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs），其中 VEGF主要是通過誘導內皮細胞表達VEGF同時分泌多種組織蛋白酶，誘導新生血管形成［8］。BFGF能促進中胚層和神經外胚層細胞分裂的多肽，具有強烈的血管生成作用［9］。IGFs是一類多功能細胞增殖調控因子，可促進體外培養的多種細胞增殖［10］，BDNF的表達通過干預PI3K／Akt信號通路［11］調控上述營養因子表達，并有相互影響作用，促進神經修復、血管生成及細胞的增殖［12］。

丹參為唇形科植物，味苦，性微寒，具有活血祛瘀、養血安神、調經止痛、涼血消癰的功效。祖國醫學認為“一味丹參，功同四物”。近年來，學者們對丹參作為誘導劑，對干細胞誘導分化為神經元樣細胞、心肌細胞等作用做了大量的研究，發現丹參的有效成分在體外實驗中其可促進植入的BMSCs向損傷部位定向募集，同時向神經干細胞標志物巢蛋白（Nestin）、神經元標志物絲蛋白（Nerulfilament protein，NF）的方向分化，且分化效率較高［13-15］。陳麗麗等［16］研究發現丹參多酚酸鹽可以明顯降低急性癲癇痙攣性大鼠的發作等級和發作時間，可能通過BDNF的表達增高來發揮作用。張偉駿等［17］研究發現，活血祛瘀解郁法治療卒中后抑郁癥的大鼠，與模型組相比，給藥組大鼠海馬表現為BDNF陽性細胞數量明顯增多，認為中藥活血祛瘀解郁方治療PSD能增強BDNF的表達，進一步保護受損的5-HT、NE等神經元，促進神經元的再生，增加遞質濃度，改善其活性，促進功能恢復，達到改善神經損傷和抗抑郁的作用。李云等［18］發現，腦卒中急性期患者神經功能缺損程度與血清BDNF含量呈負相關。

本研究與上述學者的部分研究結果相似，丹參與rhG-CSF配伍用藥組、rhG-CSF單獨用藥組，均能明顯提高BDNF的表達。丹參組及常規組不能明顯提高BDNF的表達，考慮可能兩組中自體骨髓中的干細胞未經重組粒細胞集落刺激因子動員，外周血中干細胞的數目及濃度偏低，因而相應的分泌腦源性神經生長因子較少有關。rhG-CSF用作自體骨髓干細胞動員劑，它有外源性干細胞無可比擬的優點。近10余年來，該藥被擴大用于缺血性心腦血管病，在目前國內外眾多的實驗與臨床研究中，發現該藥有神經保護和再生作用，包括修復神經祖細胞，減輕腦水腫，提高生存率，促進感覺和運動功能［19-21］。本研究認為二者配伍使用可能與通過促進中樞神經系統的神經元星形膠質細胞等產生BDNF有關，腦缺血再灌注損傷后級聯反應導致自由基、興奮性氨基酸、ET、iNO等過度產生，二者配伍使用以及rhG-CSF單獨使用在一定程度上能抑制此反應，誘導BDNFmRNA、BDNF蛋白上調，并延長其高表達時程，保護并促進內源性神經保護機能。

［1］ Hyun JaeKang，Eun JungYoon，Eun JuLee，et al.Co-treatment with darbepoetin and granulocyte-colony stimulating factor is efficient to recruit pro-angiogenic cell populations in patients with acute myocardial infarction［J］.Cell Transplantation，2012，21（5）：1055-1061.

［2］ Lanfranconi S，Locatelli F，Corti S.Growth factors in ischemic stroke［J］.Cell Mol Med，2011，15（8）：1645-1687.

［3］ 張德鳳，潘家華，張梅，等.丹參聯合骨髓間充質干細胞移植治療新生鼠缺氧缺血性腦損傷的實驗研究［J］.實用兒科學雜志，2011，26（2）：142-145.

［4］ Chekhonin VP，Lebedev SV，Volkov1AI，et al.Activation of expression of brain-derived neurotrophic factor at the site of implantation of allogenic and xenogeniec neural stem（progenitor）cells in rats with ischemic cortical stroke［J］.Cell Technologies in Biology and Medicine，2011，150（4）：515-518.

［5］ Jung YeonLim，Sang InPark，Seong MukKim，et al.Neural differentiation of brain-derived neurotrophic factor-expressing human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in culture via trkB-mediated ERK and B-catenin phosphorylation and following transplantation into the developing brain［J］.Cell Transplantation，2011，5（4）：1-47.

［6］ Keng YenFu，Lien GuoDai，Ing MingChiu，et al.Sciatic nerve regeneration by microporous nerve conduits seeded with glial cell line-derived neurotrophic factor or brain-derived neurotrophic factor gene transfected neural stem cells［J］.Artificial Organs，2011，35（4）：363-372.

［7］ Ma Haiying，Bo Yu，Li Kong，et al.Neural stem cells over-expressing brain-derived neurotrophic factor（BDNF）stimulate syn-aptic protein expression and promote functional recovery following transplantation in rat model of traumatic brain injury［J］.Neurochem Res，2011，29：137-168.

［8］ Li LQ，Gao JH，Lu F.Experimental study of the effect of adipose stoma vascular fraction cells with VEGF on the revascularization of free fat transplantation［J］.Chin J Plast Surg，2012，28（2）：122-126.

［9］ Guo S，Yu L，Cheng Y.GFRbeta triggered by buff promotes the proliferation，migration of endothelial progenitor cells via p-ERK signaling［J］.Cell Biol Int，2012，36（10）：945-950.

［10］ Jevdjovic T，Maake C，Eppler E，et al.Effects of insulin-like growth factor-1treatment on the endocreas pancreas of hypophysectomized rats：Comparision with growth hormone replacement［J］.Front Neuroendocrinol，2004，151（2）：223-231.

［11］ Zhang I，Liu G，Wu Y，et al.BDNF promotes EGF-induced proliferation and migration of human fetal neural stem／progenitor cells via the PI3K／Akt pathway［J］.Molecules，2011，16（12）：10146-10156.

［12］ Lu P，Jones LL，Snyder EY，et al.Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive host axonal growth after spinal cord injury［J］.Exp Neurol，2003，181（2）：115-129.

［13］ Tong Yinghui，Wei Xu，Hongcan Han.Tanshinone IIA increases recruitment of bone marrow mesenchymal stem cells to infarct region via up-regulating stromal cell-derived factor-1／CXC chemokine receptor 4axis in a myocardial ischemia model［J］.Phytomedicine，2011，18（6）：443-450.

［14］ Liu YR，Qu SX，Maitz MF，et al.The effect of the major components of salvia miltiorrhiza bunge on bone marrow cells［J］.Ethnopharmacology，2007，111（2）：573-583.

［15］ 余勤，羅依，鄂艷，等.丹參素定向誘導骨髓間質干細胞分化為神經元樣細胞的研究［J］.中國中西醫結合雜志，2005，25（1）：49-53.

［16］ 陳麗麗，黃靚妹，詹紅艷.丹參多酚酸鹽對匹魯卡品致癇大鼠BDNF表達的影響［J］.中國實驗診斷學，2011，15（10）：1629-1631.

［17］ 張偉駿，陳眉，裘濤.活血祛瘀解郁法對卒中后抑郁癥大鼠海馬基因BDNF表達的研究［J］.中華中醫藥學刊，2007，25（7）：1410-1411.

［18］ 李云.腦卒中急性期患者神經功能缺損程度與血清BDNF含量的相關性研究［J］.中國實用神經疾病雜志，2011，14（24）：254-255.

［19］ Kai D，Verena Q.Successful regeneration after experimental stroke by granulocyte-colony stimulating factor is not further enhanced by constraint-induced movement therapy either in concurrent or in sequential combination therapy［J］.Stroke，2012，43（1）：185-192.

［20］ 肖廣正，孔祥玉，趙淑敏.自體骨髓干細胞動員治療腦梗死的研究進展［J］.承德醫學院學報，2011，28（2）：179-181.

［21］ 杜平，張家偉，王海軍.重組人粒細胞集落刺激因子治療急性腦梗死74例療效觀察［J］.中國康復理論與實踐，2010，16（9）：809-810.